沉默膜聯蛋白A2對口腔細胞癌KB細胞遷移侵襲能力的影響

麻穎宜，王海業

口腔鱗狀細胞癌是一種常見的口腔惡性腫瘤，目前其發病率在世界惡性腫瘤中排名第六［1］。在世界范圍內每年約30萬人患口腔癌，五年存活率僅50%［2］。近些年嘗試了放射治療和化學藥物的聯合，但治療效果仍不樂觀［3］。因此，口腔鱗狀細胞癌的治療需要新的藥物和靶點。膜聯蛋白A2（Annexin A2）是膜聯蛋白家族極為重要的成員之一，大量研究結果表明AA2的異常表達和分布與腫瘤的轉移和浸潤關系密切，它可與浸潤轉移中的關鍵作用分子相互作用從而促進癌細胞的轉移［4］但目前關于AA2作用于口腔細胞癌的研究報道較少。該研究通過沉默膜聯蛋白AA2基因的表達，分析AA2表達對KB細胞浸潤及遷移的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人口腔上皮癌細胞KB細胞購自 Solarbio； 貨號：SCC-110811；ExFect2000 Transfection Reagent、反轉錄試劑盒HiScript II Q RT SuperMix for qPCR、定量PCR試劑盒為ChamQTMSYBR Color Qpcr Master Mix均購自南京諾唯贊生物公司。siRNA及陰性對照質粒由上海吉瑪生物科技公司設計并包裝。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與轉染 細胞癌KB細胞在含10%胎牛血清1×105IU/L青鏈霉素的MEM培養基上，于5%CO2、37℃的培養箱中培養。取生長良好的對數生長期細胞進行以下實驗。該實驗分為三組：空白對照組（NC組）、陰性對照組（siNC組）、干擾組（siAA2組）。取對數期細胞胰酶消化后計數鋪板，2×105/well，接種96孔板，每組設6個復孔；靜置培養過夜，待細胞融合度達到60%左右時進行轉染。分別轉染siRNA NC和Annexin A2-siRNA至陰性對照組和干擾組。轉染72 h后收樣運用試劑盒進行RT-qPCR檢測。

1.2.2 RT-qPCR檢測沉默Annexin A基因結果Trizol-離心柱法提取組織總RNA。取2 μl RNA溶液于Merinton SMA4000檢測，并計算RNA溶液濃度，判斷 RNA 提取質量：A260/A280＞2．0 且＜2．3，則可以滿足后續RT-qPCR所需。再進行AA2基因的熒光定量PCR檢測。PCR引物設計如下：Annexin A2 上游：5’ACCTGGAGACGGTGATTT， 下游：5’-TGCTCTTCTACCCTTTGC-3’。 β-actin 上 游 ：5’-GGAAATCGTGCGTGAC-3’， 下游：5’-ATGCCCA GGAAGGAA-3’。 qPCR 反應體系為 20 μl：PCR 上下游引物各 2 μl， 去離子水 4 μl，DNA 模板 2 μl。PCR 反應條件：95．0 ℃預變性 10 min，95．0 ℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 20 s，40 個循環。 95℃ 10 s，60 ℃1 min，每增加0．5℃采集5次熒光，一直達到95℃，40℃30 s，采用2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達變化，實驗重復3次。

1.3 Transwell實驗取以上各組細胞。用0．25%Typsin+0．02%EDTA 消化，離心，計數，用 2%FBS+1×P．S．MEM 培養基重懸，稀釋成 2．5×105個/ml，鋪Transwell小室的上室，下室加入 500 μl的 10%FBS+1×P．S MEM 培養基；16 h 后，PBS 清洗，用 4%多聚甲醛室溫固定15 min；PBS清洗，加入結晶紫染色15 min，PBS清洗；置于室溫下風干，顯微鏡下拍照（200×）。

1.4 細胞劃痕實驗細胞實驗同1．2，轉染6 h后換液，取對數生長期細胞接于24孔板中，每組6個孔。培養 （細胞密度為1×106個/孔），細胞融合至80%加入無血清培養液培養24 h，用200 μl的槍頭垂直于培養板劃線，用PBS洗去細胞碎片。每孔中加入含有10%血清的DMEM培養基進行培養。分別于0和24 h、48 h后于倒置顯微鏡下觀察劃痕區域的愈合情況并拍照。通過ImageJ軟件來計算愈合面積：（0 h初始劃痕寬度-現劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%；比較各組細胞的遷移情況。實驗重復3次取平均值。

1.5 統計學方法采用SPSS 19．0進行數據統計分析，計量資料用s）表示，組間數據比較用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0．05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 沉默蛋白A2的效果檢驗PCR檢測結果發現與NC組和siNC組相比，siAA2組的KB細胞中AA2mRNA水平顯著低于對照組和NC組 （P＜0．05），提示轉染成功沉默了AA2的表達。見表1。

表1 三組KB細胞內AA2的表達量

2.2 沉默AA2對各組細胞遷移的影響Transwell實驗中發現，與NC組和siNC組相比，siAA2組中細胞穿膜數量較少，與兩組相比都具有顯著性差異（P＜0．05，圖 1、2）。

圖1見封三。

下圖1：麻穎宜，王海業.沉默膜聯蛋白A2對口腔細胞癌KB細胞遷移侵襲能力的影響（正文148～150，167頁）

圖1 沉默AA2后三組細胞穿膜細胞鏡下圖（×200）

圖2 沉默AA2后三組細胞穿膜細胞數量比較圖

2.3 細胞劃痕實驗細胞細胞劃痕實驗檢測沉默A2基因后細胞遷移能力的變化。結果顯示劃痕24 h和48 h后siAA2組中細胞愈合面積相對于NC組和siNC相比明顯較少且具有統計學意義 （P＜0．05），說明AA2基因的沉默能有效抑制KB細胞的遷移，對腫瘤細胞的增殖起到重要的作用。見圖3、表2。

圖3 各組KB細胞在細胞劃痕后不同時間不同組別間愈合面積情況（×200）

表2 沉默AA2基因后各組細胞劃痕后愈合面積比較±s，%）

表2 沉默AA2基因后各組細胞劃痕后愈合面積比較±s，%）

注：與 NC 組比較，＊P＜0．05；與 siNC 組比較，#P＜0．05。

組別 0 h 24 h 48 h NC 0 52±5 90±4 siNC 0 51±6 89±3 siAA2 0 43±6＊# 78±4＊#F 值 - 4．550 19．463 P 值 - 0．029 0．000

3 討論

口腔癌是我國常見的口腔惡性腫瘤之一，嚴重危害患者的身心健康［5］。腫瘤的遠處轉移是患者預后差和生存率低的主要原因之一，但腫瘤細胞的侵襲和轉移是一個多因素復雜的過程，其機制尚不完全明確［6］，該過程的相關蛋白和特異性分子仍需要進一步深入研究。

AA2基因過表達可促進惡性腫瘤的進展，與腫瘤的浸潤和遷移有著密切的關系。經研究發現，膜聯蛋白A2基因的過表達可使子宮內膜癌、結直腸癌、腎癌進一步惡性發展［7］。另有研究顯示，AA2基因在腫瘤中尤其是高發性腫瘤中存在過表達［8］。有研究證明，對2321例患者14種腫瘤的Meta分析結果表明AA2基因的表達與患者的預后呈正相關［9］。也有學者通過一系列實驗表明，AA2可能與口腔鱗癌細胞的分型、癌灶體積、分期以及淋巴結轉移浸潤有關［10］。該研究選用高轉移性口腔細胞癌KB細胞，用siRNA技術沉默膜聯蛋白A2的表達，研究Si-A2基因沉默后對口腔癌細胞KB遷移和侵襲的影響。結果顯示，siRNA轉染沉默AA2基因后，其mRNA水平顯著降低，提示AA2基因干擾成功；后續實驗結果表明，siAA2組細胞的穿膜數與對照組相比顯著減少，提示KB細胞中AA2基因的沉默可有效抑制細胞的浸潤侵襲能力。細胞劃痕實驗中細胞培養24 h及48 h時Si-AA2組細胞的愈合面積最小相對于對照組具有顯著性差異，進一步說明沉默AA2基因可減弱口腔細胞癌KB細胞遷移能力。與現有研究結論基本一致。纖維蛋白溶酶可激活基質金屬蛋白酶（MMPs）尤其是MMP-1活化從而導致膜蛋白的水解和細胞外基質的降解等，進而導致血管外周基膜降解，造成腫瘤細胞的遷移［11］。有研究表明AA2蛋白經過一系列反應可生成PL，所以推測AA2有可能通過此途徑影響腫瘤細胞的遷移侵襲能力［12，13］。但這一機制是否也發生在口腔鱗狀細胞癌中仍需要進一步實驗證實。

綜上所述，該研究認為沉默AA2蛋白可有效抑制口腔細胞癌KB細胞的生殖遷移和侵襲能力，為臨床口腔細胞癌治療靶標的新思路奠定一定基礎。但目前本研究未對該過程機制進行闡明，還需后續實驗進行驗證及深入研究，以探討AA2調控口腔細胞癌KB細胞的遷移和侵襲的機制。