微小RNA-205 對鼻咽癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力的影響

徐光，千建峰，劉濤

鄭州人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，鄭州4500000

鼻咽癌是一種惡性程度較高的頭頸部惡性腫瘤，中國南方地區(qū)鼻咽癌的發(fā)病率明顯高于北方，存在一定的地域差異[1]。鼻咽癌的發(fā)病較為隱匿，且惡性程度較高，因此，預(yù)后較差[2]。目前，尚不清楚鼻咽癌發(fā)生的確切機(jī)制，普遍認(rèn)為鼻咽癌的發(fā)生可能與基因突變、基因易感性、外界環(huán)境、飲食習(xí)慣等因素有關(guān)，是多因素綜合作用所致[3-4]。微小RNA（microRNA，miRNA）是 一 類 非 編 碼 小RNA，其參與靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，與機(jī)體的生理、病理過程密切相關(guān)，尤其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5-6]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-205在頭頸部惡性腫瘤、消化系統(tǒng)惡性腫瘤、婦科惡性腫瘤等多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用[7-9]。研究顯示，miRNA-205 在鼻咽癌組織中異常表達(dá)[10]。本研究對miRNA-205 對鼻咽癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響進(jìn)行探討，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

鼻咽癌細(xì)胞SUNE-1、HONE1、CNE2、C666-1、6-10B 均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。DMEM 培養(yǎng)基購自上海源培生物科技股份有限公司，胎牛血清購自天津康源生物技術(shù)有限公司，miRNA-205 引物、miRNA-205 minics、miRNA-205 inhibitor 和陰性對照質(zhì)粒均由上海生工生物工程有限公司合成，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Ⅱ?qū)崟r熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司，LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 鼻咽癌細(xì)胞SUNE-1、HONE1、CNE2、C666-1、6-10B 均采用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至80%融合度時進(jìn)行傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。于轉(zhuǎn)染前1 天將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，不加抗生素。選取miRNA-205 相對表達(dá)量最高和最低的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書的操作步驟將miRNA-205 minics、miR‐NA-205 inhibitor 和陰性對照質(zhì)粒NC 轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h 后，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的生物學(xué)功能檢測實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)時熒光定量PCR 法檢測miRNA-205 的相對表達(dá)量 收集正常培養(yǎng)的SUNE-1、HONE1、CNE2、C666-1、6-10B 細(xì)胞，采用Trizol 試劑從各細(xì)胞中提取總RNA，DEPC 水溶解，使用紫外分光光度計測定RNA 質(zhì)量和濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，cDNA 產(chǎn)物于4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ缓螅凑誗YBR GreenⅡ?qū)崟r熒光定量PCR 試劑盒操作說明書的步驟進(jìn)行實(shí)時定量PCR檢測。PCR 的反應(yīng)條件：95 ℃2 min 預(yù)變性（1 個循環(huán)）；92 ℃15 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共35 個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法分析各細(xì)胞中miRNA-205 的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 噻唑藍(lán)（MTT）法檢測細(xì)胞增殖能力 轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞，以5000/孔細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)5 個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96 h后，采用MTT 法檢測細(xì)胞的增殖能力，即每孔加入5 mg/ml 的MTT 溶液20 μl，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出96 孔培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μl二甲基亞砜，振蕩混勻，采用酶標(biāo)儀于490 nm波長處分別檢測轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h 后的細(xì)胞的吸光度（absorbance，A）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞集落形成能力 轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞，將800 個細(xì)胞接種于10 ml 培養(yǎng)皿中，在正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)細(xì)胞2 周后，棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液輕柔沖洗3 次，加入4%多聚甲醛，室溫固定20 min，棄去固定液，用去離子水緩慢沖洗干凈，加入1 ml 結(jié)晶紫染液，染色3 min 后，再用去離子水緩慢洗去染色液，于顯微鏡下觀察各細(xì)胞的集落形成能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力 轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞，以無血清培養(yǎng)基稀釋成細(xì)胞懸液，在進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)時，上室加入200 μl 含20 000 個細(xì)胞的懸液，下室加入600 μl 含血清的完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，吸去上室培養(yǎng)液，用棉簽擦去上室膜的細(xì)胞后，使用磷酸鹽緩沖液洗滌滲透膜下層，于4%多聚甲醛溶液中室溫固定20 min，用吉姆薩染液染色10 min，于顯微鏡下計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)目。在進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)時，需先將matrigel 加入Transwell 上室，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，其余操作步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-205 在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)情況

實(shí)時熒光定量PCR 檢測結(jié)果顯示，SUNE-1、HONE1、CNE2、C666-1、6-10B 細(xì)胞中miRNA-205的相對表達(dá)量分別為（0.89±0.10）、（0.08±0.02）、（1.12±0.24）、（0.04±0.02）、（0.43±0.07）。CNE2 細(xì)胞中miRNA-205 的相對表達(dá)量最高，C666-1 細(xì)胞中miRNA-205 的相對表達(dá)量最低，選取CNE2 和C666-1 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。CNE2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR‐NA-205 inhibitor 后，miRNA-205 的 相 對 表 達(dá) 量 為（0.19±0.03），低于陰性對照細(xì)胞的（1.37±0.24），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.450，P＜0.05）；C666-1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-205 minics 后，miRNA-205 的 相 對 表 達(dá)量為（1.96±0.29），高于陰性對照細(xì)胞的（0.11±0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.043，P＜0.05）。

2.2 miRNA-205 對細(xì)胞增殖能力的影響

MTT 檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-205 inhibi‐tor 96 h 時，CNE2 細(xì)胞的A 值為（3.76±0.79），低于陰性對照細(xì)胞的（5.81±0.83），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.221，P＜0.05）；轉(zhuǎn)染miRNA-205 minics 96 h時，C666-1 細(xì)胞的A 值為（6.29±0.87），高于陰性對照細(xì)胞的（4.94±0.68），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.546，P＜0.05）。（圖1）

圖1 miRNA-205對鼻咽癌細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 miRNA-205 對細(xì)胞集落形成能力的影響

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-205 in‐hibitor 的CNE2 細(xì)胞形成的細(xì)胞集落數(shù)目為（182.09±26.43）個，少于陰性對照細(xì)胞的（371.25±34.18）個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.583，P＜0.05）；轉(zhuǎn)染miRNA-205 minics 的C666-1 細(xì)胞形成的細(xì)胞集落數(shù)目為（561.63±73.28）個，多于陰性對照細(xì)胞的（329.55±42.70）個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.740，P＜0.05）。

2.4 miRNA-205 對細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-205 inhibitor的CNE2 細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)目為（8.93±1.42）個，少于陰性對照細(xì)胞的（17.26±2.11）個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.673，P＜0.05）；轉(zhuǎn)染miRNA-205 minics 的C666-1 細(xì)胞的遷移數(shù)目為（25.17±2.45）個，多于陰性對照細(xì)胞的（14.92±1.33）個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.368，P＜0.05）。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR‐NA-205 inhibitor 的CNE2 細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)目為（7.36±1.02）個，少于陰性對照細(xì)胞的（14.83±1.74）個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.415，P＜0.05）；轉(zhuǎn)染miRNA-205 minics的C666-1細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)目為（23.80±2.07）個，多于陰性對照細(xì)胞的（14.26±1.37）個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.674，P＜0.05）。（圖2）

圖2 miRNA-205對鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

3 討論

鼻咽癌是一種惡性程度較高的頭頸部惡性腫瘤，其病因復(fù)雜多樣，可能與個體自身的飲食習(xí)慣、生存環(huán)境、基因易感性等有關(guān)[11-12]。目前，鼻咽癌的臨床治療效果并不十分理想，尤其是中晚期患者的5 年生存率僅為50%左右[13]。因此，探尋準(zhǔn)確、有效的早期診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)對于改善鼻咽癌患者的預(yù)后具有重要意義。

miRNA是一類小分子非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，與機(jī)體的生理及病理過程密切相關(guān)，并參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[14-15]。研究顯示，miRNA 與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)[16-17]。Zhen 等[18]研 究 發(fā) 現(xiàn)，miRNA-3188 可 通 過 介 導(dǎo)FOXO1 從而抑制鼻咽癌細(xì)胞的惡性表型。Petrosi‐no 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-143 的異位表達(dá)能夠抑制鼻咽癌細(xì)胞的活力，并抑制體內(nèi)異種移植腫瘤的生長。miRNA-205是miRNA家族的成員之一，研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-205 在包括鼻咽癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中異常表達(dá)[20]，但其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用卻存在爭議，有研究認(rèn)為，其可作為抑癌基因抑制腫瘤的發(fā)生，亦可作為促癌基因促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[21-22]。

本研究選擇了SUNE-1、HONE1、CNE2、C666-1、6-10B 這5 種 鼻 咽 癌 細(xì) 胞 系，發(fā) 現(xiàn)miRNA-205 在CNE2 細(xì)胞中的相對表達(dá)量最高，在C666-1 細(xì)胞中的相對表達(dá)量最低，因此，選取CNE2和C666-1細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，并通過實(shí)時熒光定量PCR 確認(rèn)了CNE2、C666-1 細(xì)胞分別敲低或過表達(dá)miRNA-205。本研究首次研究了敲低或過表達(dá)miRNA-205 對鼻咽癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力的影響，結(jié)果顯示，敲低miRNA-205 后，CNE2 細(xì)胞的增殖能力降低，集落數(shù)目減少，而過表達(dá)miRNA-205 后，C666-1細(xì)胞的增殖能力提高，集落數(shù)目增多，這與高英和謝麗[23]的研究結(jié)果相一致，表明下調(diào)miRNA-205的表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力，反之，上調(diào)miRNA-205 的表達(dá)可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力。分析原因可能與miRNA-205 可通過調(diào)控P21、cyclin D1基因的表達(dá)，從而參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)[24]。本研究進(jìn)一步探究了miRNA-205 表達(dá)情況對細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，結(jié)果顯示，敲低miRNA-205 后，CNE2 細(xì)胞的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目均減少，而過表達(dá)miRNA-205 后，C666-1 細(xì)胞的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)目均增多，表明下調(diào)miRNA-205 的表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，反之，上調(diào)miRNA-205 的表達(dá)可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

綜上所述，miRNA-205 可作為促癌基因在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮促進(jìn)作用，下調(diào)miR‐NA-205 的表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，miRNA-205 有可能成為鼻咽癌基因治療的潛在作用靶點(diǎn)。