AECA、VEGF在自身免疫性肺氣腫大鼠中的表達及甲潑尼龍琥珀酸鈉的干預(yù)效果

張朝杰，尚會娜,2，孫廣信

(1.鄭州市第一人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，河南 鄭州 450000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州 遵義 563000)

近年來有研究[1-2]表明，抗血管內(nèi)皮細胞抗體(anti-endothelial cells antbodies，AECA)及血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)參與慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的發(fā)生及惡化，其作用機制尚不清楚，能否被常規(guī)免疫抑制劑(甲潑尼龍琥珀酸鈉，簡稱甲強龍)逆轉(zhuǎn)鮮少報道。本研究通過建立自身免疫性肺氣腫大鼠模型，觀察甲強龍對血清、支氣管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid，BALF)中AECA、VEGF水平及肺泡隔細胞凋亡指數(shù)等的影響及各指標相關(guān)性，為肺氣腫的防治提供一定科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料大鼠AECA、VEGF試劑盒(武漢博士德生物工程公司)；注射用甲強龍(美國輝瑞公司有限公司)；550酶標儀(美國Bio-Rad公司)；DL-低速大容量離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；BX41TF型光學(xué)顯微鏡(日本OLYBUS公司)；完全弗氏佐劑(美國sigma公司)；原位細胞凋亡末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)(TUNEL)檢測試劑盒(瑞士Roche公司)。健康清潔SD雄性大鼠30只[許可證號：SCXK(豫)2017-016，NO：0201754，鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供]，鼠齡為10周左右，體質(zhì)量為(180.0±30.0)g。本實驗上報鄭州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會備案。

1.2 實驗方法

1.2.1自身免疫性肺氣腫大鼠模型組、干預(yù)組及對照組的建立 采用隨機數(shù)表法將30只SD大鼠分為對照組、模型組、干預(yù)組。參照文獻[3]的方法建立自身免疫性肺氣腫模型：取4～6代人臍靜脈內(nèi)皮細胞1×107加入1 mL完全弗氏佐劑，制備成“油包水”乳狀液，注入模型組大鼠腹腔內(nèi)。給予干預(yù)組大鼠上述等量的人臍靜脈內(nèi)皮細胞和完全弗式佐劑懸浮液，同時給予甲強龍10 mg·kg-1·d-1[4]。對照組大鼠僅接受1 mL完全弗式佐劑腹腔內(nèi)注射。在實驗室按晝夜節(jié)律采光12 h，通風(fēng)條件良好，室內(nèi)溫度保持在20 ℃左右，每隔3 d消毒1次。大鼠自由取食、飲水。全部營養(yǎng)飼料購于鄭州大學(xué)實驗動物中心。21 d后處死所有大鼠，隨后進行如下檢測。

1.2.2大鼠肺組織病理標本制作及形態(tài)學(xué)定量分析 參照文獻[5]的方法行支氣管肺泡灌液術(shù)、肺組織分離及相關(guān)處理。于左肺行支氣管肺泡灌洗收集BALF(回收率80%～90%)，離心取上清液，移入無菌瓶，保存于-70 ℃冰箱中待測。結(jié)扎左主支氣管、右中上肺支氣管，40 g·L-1多聚甲醛注入右下肺，胸膜鋪平，右下肺邊緣膨脹變銳，30 min后取出右下肺，放入多聚甲醛中固定24 h。石蠟包埋、切片，常規(guī)蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，光鏡下觀察HE染色的肺組織，按張程等[6]所敘述的方法計算平均內(nèi)襯間隔(mean liner intercept，MLI)和平均肺泡數(shù)(mean alveolar number，MAN)。

1.2.3細胞因子檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immuno-sorbent，ELISA)測定血清、BALF中AECA、VEGF水平，嚴格按ELISA試劑盒說明書進行操作。

1.2.4肺泡隔細胞凋亡檢測 采用TUNEL法檢測肺泡隔細胞凋亡情況，按試劑盒說明書步驟進行，計算各組中肺泡隔細胞凋亡指數(shù)(apototic index，AI)。AI為TUNEL陽性細胞數(shù)占肺泡隔總細胞數(shù)的百分比，每例標本取3張切片，每張切片觀察5個高倍視野(×400)。

2 結(jié)果

2.1 肺組織HE染色切片對照組氣道結(jié)構(gòu)清楚，氣管內(nèi)表面纖毛整齊規(guī)整、豐富，未見脫落現(xiàn)象，肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡隔清晰可見，有少許炎癥細胞浸潤。模型組及干預(yù)組氣道及肺泡內(nèi)可見較多炎癥細胞浸潤，纖毛脫落、倒伏，肺泡隔變薄甚至部分斷裂，相互融合，形成肺大泡。干預(yù)組較模型組變化輕。見圖1。模型組MLI較對照組高，MAN較對照組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。干預(yù)組MLI較模型組低，MAN較模型組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

A

B

C

A為對照組，B為模型組，C為干預(yù)組。

圖1各組大鼠肺組織病理染色結(jié)果(HE染色，×100)

表1 3組大鼠MLI、MAN比較

注：與對照組比，aP<0.05；與模型組比，bP<0.05； MLI—平均內(nèi)襯間隔，MAN—平均肺泡數(shù)。

2.2 各組大鼠AECA、VEGF水平比較模型組血清及BALF中AECA水平高于對照組，VEGF水平低于對照組，干預(yù)組血清及BALF中AECA水平低于模型組，VEGF水平高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

2.3 各組AI比較對照組、模型組、干預(yù)組的AI分別為8.73±3.26、25.68±5.49、14.25±4.32。模型組AI比對照組高，干預(yù)組AI比模型組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見圖2。

表2 各組大鼠AECA、VEGF水平比較

注：與正常對照組比，aP<0.05；與模型組比，bP<0.05；AECA—抗血管內(nèi)皮細胞抗體，VEGF—血管內(nèi)皮細胞生長因子，BALF—支氣管肺泡灌洗液。

2.4 各組指標相關(guān)性模型組、干預(yù)組大鼠血清AECA水平與VEGF水平呈負相關(guān)(r=-0.652，P<0.05)，AECA水平與AI呈正相關(guān)(r=0.524，P<0.05)，VEGF水平與AI呈負相關(guān)(r=-0.564，P<0.05)。模型組、干預(yù)組BALF中AECA水平與VEGF水平呈負相關(guān)(r=-0.546，P<0.05)，AECA水平與AI呈正相關(guān)(r=0.638，P<0.05)，VEGF水平與AI呈負相關(guān)(r=-0.513，P<0.05)。

A

B

C

A為對照組，B為模型組，C為干預(yù)組。

圖2各組大鼠肺泡隔細胞凋亡情況(TUNEL法染色，×400)

3 討論

AECA是一種可與血管內(nèi)皮細胞表面結(jié)構(gòu)抗原結(jié)合導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞退化和凋亡的抗體[7]。焦油、尼古丁等外源性化合物在肺部沉積，誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)發(fā)生，抗核抗體、抗組織抗體及AECA等自身抗體顯著增多[2-3,5]，VEGF減少[8]，導(dǎo)致肺泡間隔血管內(nèi)皮細胞退化，肺泡間隔破裂，導(dǎo)致肺氣腫形成。張璐等[5]發(fā)現(xiàn)吸煙致肺氣腫大鼠血清、BALF中AECA較對照組增多，提示AECA可能參與肺氣腫的形成。本實驗發(fā)現(xiàn)模型組血清、BALF中AECA水平增高，VEGF水平降低，AECA水平與VEGF水平呈負相關(guān)，與AI呈正相關(guān)，說明AECA水平升高及VEGF水平降低可能促進肺泡隔細胞凋亡，導(dǎo)致肺泡隔變薄，部分肺泡破裂融合，肺形成氣腫。

甲強龍是臨床常用的高效、速效糖皮質(zhì)激素類藥物，具有較強的抗炎、免疫抑制、抗休克等作用。有關(guān)資料顯示，糖皮質(zhì)激素可能通過抑制AECA的過度表達，緩解類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫系統(tǒng)疾病的進程。張璐等[5]研究顯示甲強龍干預(yù)的吸煙致肺氣腫大鼠AECA水平低于未干預(yù)組，表明糖皮質(zhì)激素可能干預(yù)AECA的表達而抑制肺氣腫形成。韓婧等[8]發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素可能參與控TNF-α、MMP-9、VEGF、VEGFR-2表達及抑制肺泡隔細胞凋亡，從而抑制大鼠自身免疫性肺氣腫形成。本研究發(fā)現(xiàn)干預(yù)組大鼠血清、BALF中AECA水平較模型組低，VEGF水平較模型組高，肺泡隔細胞凋亡數(shù)較少，AECA水平與VEGF水平呈負相關(guān)，提示糖皮質(zhì)激素可能通過抑制AECA的過度表達，提高VEGF的表達，從而抑制肺泡隔細胞凋亡，對肺氣腫的治療有一定作用。

綜上所述，AECA、VEGF參與自身免疫性肺氣腫大鼠肺泡隔細胞凋亡，其機制可能為AECA表達增高導(dǎo)致VEGF表達下降，甲強龍可能通過影響AECA、VEGF水平導(dǎo)致肺泡隔細胞凋亡下降，進而抑制肺氣腫的形成。