冠狀動脈粥樣硬化新生滋養血管節段異質性及其對鈣化出血的作用

蔡 輝 趙施竹

河南省鶴壁煤業公司總醫院ICU科，河南省鶴壁市 458000

動脈粥樣硬化是一種進行性、血管壁炎癥病變，可開始于生命早期，表現為脂質條并進展為突出病變，成年時形成成熟斑塊，常含有羥磷灰石鈣沉積[1]。粥樣硬化斑塊組織學范圍和鈣鹽沉積之間有高度相關性[2]。習慣上講，血管外壁，包括外膜層和滋養血管(VV)，在粥樣硬化中起被動作用。 與此相反，有報道認為外膜層在維持血管完整性方面具有重要作用，對于粥樣硬化啟動和進程及重塑過程亦有影響[3]。實驗研究表明外膜的處理，更為特別的是滋養血管，可導致內層改變，類似粥樣硬化過程[4]。大動物模型使用微型計算機斷層(micro-CT)技術，發現早期粥樣硬化與滋養血管新生有關[5]。 其他的機制包括VV通過介導、定位及促進脂質進入和炎癥細胞浸潤而加快粥樣硬化進程，這些都是不穩定斑塊的特征[6-7]。 而且，新形成滋養血管的脆弱性有泄漏或破裂的傾向可能介導斑塊內出血，是動脈粥樣硬化病變發生過程中常發生的重要事件[8]，可發展為斑塊破裂，最終導致血栓形成或血管急性閉塞[9-10]。 因而，可以推測VV新生與動脈粥樣硬化啟動和進展相關，主要是通過細胞增生、游移和斑塊內基質生成。本研究的目的是觀察冠狀動脈節段VV新生與滋養血管破裂并發癥和斑塊內出血的關系。

1 材料和方法

1.1 材料 50段冠狀動脈(取自20支冠狀動脈： 左前降支10支、右冠動脈5支、回旋支5支) 取自15例患者尸體解剖。動脈段的組織學分類正常(無粥樣斑塊，n=12)、非狹窄斑塊(輕微或無腔內斑塊損害，管腔狹窄<50%，n=18)、非鈣化狹窄 (管腔斑塊損害，管腔狹窄>50%，斑塊鈣化面積<50%，n=10)、鈣化狹窄斑塊 (>50%的管腔狹窄及>50%斑塊鈣化面積,n=10)。

1.2 Micro-CT分析

1.2.1 標本制備和成像：在尸檢過程中，對心臟進行特殊護理，以保護動脈周圍的組織，避免損傷外膜。冠狀動脈注射 MicrofilTM(Flow Tech,Inc.Carver,MA)，為進行micro-CT 掃描做準備[11]。

1.2.2 分析： 應用 Analyze?software (Biomedical Imaging Resource,Rochester,MN)進行數據分析。對每段以400μm間距切片 35～40層[12]。對每層 micro-CT 切片，根據文獻[5,11]方法確定血管壁區域(由外膜的外邊界確定)，按照文獻[13]確定滋養血管參數。使用連接工具，包括 Analyze?software，對動脈進行3D成像。如圖1，該工具能識別各VV血管“樹”并追蹤其起源。這樣可將內部VV(直接起源于主腔)和外部VV(起源于主要冠狀動脈分支)加以區分[11]。隨后2D成像分析只包括那些實際灌注的VV，即與系統循環連接者，不包括離外膜很近但實際上不是VV的血管。

圖1 冠狀動脈斑塊和VV容積成像
注：三維微CT圖像顯示的冠狀動脈腔為紅色，非鈣化和鈣化斑塊區域由箭頭表示。

1.3 組織學檢查 石蠟包埋后，將動脈橫切面切片置于載玻片上，用H&E染色。采用平行組織切片法對微CT圖像進行外周邊界追蹤和VV識別的準確性已經有文獻進行了驗證[11]。

1.3.1 Von Kossa 鈣染色：切片經脫蠟、蒸餾水水化，放入6%硝酸銀孵育箱中30min；此后，切片用蒸餾水沖洗，5%硫代硫酸鈉孵育5min；切片用自來水沖洗5min，0.1%的核固紅染色3min。 用蒸餾水沖洗后， 切片在顯微鏡下觀察(圖2)。

圖2 鈣化狹窄斑塊的Micro-CT和組織學注：A:LAD切片的H&E染色標記顯微CT與組織學匹配的解剖學標志 B:與同一水平的組織學切片相應的微CT圖像，斑塊鈣化顯示黑色強度信號，腔內光亮為 Microfil C:圖A放大后 D:圖B 切片上游micro-CT E～H:鈣化區的不同染色。

1.3.2 血型糖蛋白A染色：脫蠟組織學切片應用抗血型糖蛋白A(CD235a,1∶100;DakoCytomation)識別非鈣化和鈣化斑塊內紅細胞碎片(圖3)。正常人類骨髓切片用于陽性對照。我們沒有在正常的冠狀動脈段中觀察到紅細胞碎片的證據，但是在動脈粥樣硬化斑塊段中有明顯的陽性染色。

圖3 不同的動脈粥樣硬化期的血型蛋白A染色 注：糖合蛋白A染色與正常(A)、非狹窄(B)和狹窄斑塊(C)的蘇木(左)對照，并進行相應的放大(右)。

1.3.3 Mallory’s 鐵染色：脫蠟與水化后，切片應用亞鐵氰化鉀/鹽酸溶液(50ml 5% 亞鐵氰化鉀,50ml 5%鹽酸)染色10min。將切片用蒸餾水沖洗，核固紅染色5min，流動水沖洗2min，放顯微鏡下觀察。

1.3.4 VEGF、TNF-α和eNOS 染色：切片厚4mm。應用抗原回收溶液進行抗原回收。然后用5%的過氧化氫將切片封堵15min。因子Ⅷ抗體(1∶50)內持續30min。 Dako LSAB2工具包用于二級和三級步驟。使用 Dako DAB顯色劑。之后，切片置于相應抗體內60min(eNOS, predilute;VEGF,1∶250,TNF-α,1∶50)。Dako LSAB2-AP 試劑盒用于后半部染色，接著用Permanent Red 顯色。

1.3.5 血型糖蛋白A和鐵評分：血管壁/斑塊區的血型糖蛋白A和鐵沉積用半定量進行分級(0～4)，分值越高表示百分值越高(1：<25%, 2：>25%但<50%,3：>50%但<75%,4：>75%)。

1.4 統計學方法 連續變量數值以平均值 ± 標準差表示，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Tukey-Kramer事后檢驗(Tukey-Kramer post hoc test)，并對多項比較進行校正，以確定各組間的統計差異。個體組間比較采用非配對學生t檢驗。 統計顯著性接受值為P<0.05。

2 結果

2.1 患者與動脈段的特征 臨床資料見表1。死亡原因：創傷8例，感染6例，自殺1例。

表1 15例患者特征

注：1mmHg=0.133kPa。

2.2 Micro-CT 資料 非狹窄和非鈣化狹窄斑塊VV空間密度顯著高于正常和鈣化狹窄斑塊段(表2)。鈣化斑塊段 VV密度與正常段相似。與正常斑塊和鈣化斑塊段比，這些數據也可理解為非狹窄和非鈣化斑塊中VV血管面積分數和VV內皮表面分數顯著高于正常斑塊和鈣化斑塊段。 將血管壁內所有VV內皮表面加起來，接近45%～67%鈣化主腔內皮表面通過非狹窄和非鈣化狹窄斑塊血管壁上的VV，顯著高于正常段的17%。雖然，鈣化狹窄斑塊段與正常段比，VV密度和分數無明顯差異， 在32%的情況下，鈣化斑塊通過VV獲得的內皮交換表面仍明顯多于正常血管壁(表2)。與所有其他節段相比，非鈣化性狹窄斑塊節段的外/內VV比值明顯高于其他節段，與正常節段比，非狹窄斑塊的比例較高。

表2 Micro-CT和組織學分析

注：*與正常比較，P<0.01；#與正常比較，P<0.001；A與非狹窄斑塊比較，P=0.001；B與鈣化狹窄斑塊比較，P<0.05；C與鈣化狹窄斑塊比較，P<0.01；D與鈣化狹窄斑塊比較，P<0.001。

2.3 組織學 van Kossa(鈣沉積),Mallory’s(鐵、含鐵血黃素) 和 血型糖蛋白A染色(紅細胞碎片)可識別斑塊內出血，這些出血可能是通過非鈣化和鈣化斑塊的滋養血管破裂(圖2和圖3)。有趣的是，斑塊鈣化與鐵和血型糖蛋白A染色的關系提示復發斑塊內出血與斑塊鈣化有關聯(圖2)。VV密度與鈣化面積負相關(r=0.42,P<0.001,圖4)。

VV的進一步表征顯示內皮一氧化氮合酶(eNOS)染色，炎癥標記物為腫瘤壞死因子-α(TNF-α)而不是血管內皮生長因子(VEGF,圖4)。不同斑塊類型之間上述染色無顯著差異，除了病變冠狀動脈段內VV TNF-α染色趨于更高的陽性外。

2.4 血型糖蛋白A和鐵評分 如圖3和表2，非鈣化狹窄斑塊段和非狹窄段比正常段和鈣化斑塊段血型糖蛋白A分值高。 VV密度和鐵評分與VV密度和血型糖蛋白A評分的 Kendall-Tau-brank 相關系數分別為 0.65 (P<0.01) 和0.58 (P<0.01)。

注：為了進一步描述冠狀VV的特征，圖A：VV 的H&E染色，圖B：eNOS染色，圖C：TNF-α，圖D：VEGF。雖然 VV內皮細胞表達eNOS和TNF-α，但未見 VEGF表達。

3 討論

本研究顯示不同階段粥樣硬化人體冠狀動脈的滋養血管分布形式有顯著差異。非狹窄斑塊段動脈滋養血管密度較高，非鈣化狹窄斑塊段則進一步增加。 總之，非狹窄和狹窄斑塊新生滋養血管與斑塊內出血的組織學標志相關。不過，一旦斑塊明顯鈣化，VV密度顯著減少與正常段無差異水平。 事實上，VV密度和鈣化動脈段鈣化面積負相關。可是，與正常段相比，鈣化斑塊段具有較高的血型糖蛋白 A和鐵評分，表明過去的斑塊內出血。 因此，本研究進一步支持外膜新生滋養血管和動脈粥樣硬化進展和并發癥之間有關聯。

動脈粥樣硬化過程在血管樹表面分布具有異質性，正如觀察尸體解剖和冠狀動脈造影T及血管內超聲檢查一樣[14]。 這種不均勻表達的機理可以部分地用分岔區和曲線區不同的剪應力來解釋[15]。然而，血流動力學機制可能不能完全解釋斑塊在動脈段內甚至在同一橫截面上分布的異質性。因此， 確定斑塊啟動和進展及鈣化的共同因素就顯得尤為重要，這樣可以準確評價斑塊負擔， 修改疾病的自然歷史。應用 micro-CT，已經證明人體和豬循環，不同血管床的外膜滋養血管密度不均質性，與動脈粥樣硬化敏感性相關[11-12]。另外，研究發現高膽固醇豬冠狀動脈比正常豬的VV密度增加，提示外膜滋養血管在早期動脈粥樣硬化重塑過程中起重要作用，這些可能發生于血管功能改變和斑塊形成之前。

輕微動脈粥樣硬化血管外膜呈現VV增生，結果增加VV數量和密度。根據3D分析，VV新生血管在外部VV水平明顯，動脈粥樣硬化過程中外部VV和內部VV的比例<1，雖然文獻報道內部VV生長受新內膜形成刺激，可能是由于組織對氧氣的需求增加[9]。這種外膜重構在明顯斑塊內進一步增加。雖然新生的VV可作為對抗血管壁缺血的補償機制，廣泛VV網可能作為巨噬細胞和炎癥因子進一步進入的管道，可能潛在地促進炎癥和斑塊形成過程。事實是，血管生成抑制降低斑塊內和滋養血管周圍巨噬細胞。

應用免疫組織化學對VV進一步觀察，顯示所有斑塊類型的eNOS表達、特別是病變段的TNF-α增加，研究未觀察到VEGF表達, 可能受到樣本年齡和加工方法影響。伴隨動脈粥樣硬化的新血管形成過程，致使許多新血管形成，從而增加斑塊內出血的可能性。 新生微血管的彎曲和脆弱也促進了這一過程。斑塊內出血與壞死核大小和冠狀動脈斑塊不穩定性增加相關[6]。然而，最終斑塊破裂之前，血液產物在斑塊間質內沉積可能對進一步刺激炎癥過程有作用，其次是組織和纖維化，最終導致鈣沉積。

冠狀動脈鈣化是動脈粥樣硬化的病理特征，與斑塊負擔相關，與阻塞的程度無關。識別和量化動脈鈣化是預測心血管風險的可靠方法，特別是調整年齡和性別時的鈣化評分。 動脈鈣化開始于動脈粥樣硬化早期階段，代表礦化和羥基磷灰石晶體沉積的活性過程[2]。 此外，近期研究表明微鈣化與斑塊易損及正向重塑相關[5]。然而，鈣化過程機制和起源，是否為損傷即炎癥的一部分，或是涉及包括成骨內皮祖細胞修復過程的一部分[6]，仍然有待研究。