外源性類活性氧誘導直腸癌細胞凋亡的機制

文雅蕾 趙 芳 徐宇翔 丁 良

河北大學，河北省保定市 071000

結腸直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是消化道最常見的腫瘤，其發病率和死亡率已經位居全球第三[1]，約占所有新發腫瘤的20%[2]。目前可治療CRC的方式主要是手術及全身化療?；熕幬镫m能顯著抑制CRC的發展，但容易使腫瘤對藥物產生耐藥性，使預后效果變差[3]。鑒于結腸直腸癌在我國及全球范圍內的高發病率和高致死率，尋找新的作用靶點對非小細胞肺癌的研究有治療意義[4]?，F在認為活性氧(ROS)可以作為調節癌癥中各種生理過程的信號分子[5-6]。當氧化—抗氧化系統失衡時，會激活氧化應激，引起DNA、脂質、蛋白質和其他生物大分子的損傷，ROS的增加在癌癥的病因和發病機制中起重要作用[7]。因此，改變細胞內ROS水平有助于控制癌癥的發生和發展。HClO是ROS的家族成員之一，是一種強氧化劑，在許多細胞的生物過程中起著重要的作用。最近有證據表明，內源性HClO可以作為激活半胱天冬酶和介導細胞凋亡的信號。目前尚無明確報道顯示HClO對癌細胞的殺傷作用[8]。因此，我們以內皮細胞Ealy926和直腸癌細胞HCT-8的作用和機制,初步探討HClO對其生物學影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 內皮細胞Ealy926 購自中山大學細胞庫，直腸癌細胞HCT-8購自中國典型培養物保藏中心(CCTCC?，武漢，中國)；含有1%青霉素/鏈霉素混合物的DMEM培養液、0.25%胰酶均購自加拿大WISENT 公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；MTT購自美國Sigma公司；Giemsa染液購自北京索萊寶科技有限公司；AnnexinV-FITC試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 細胞培養 HCT-8細胞購自中國典型培養物保藏中心(CCTCC?，武漢，中國)。在補充有10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/鏈霉素混合物溶液的高葡萄糖Dulbecco’s改良Eagle培養基(H-DMEM)中培養。

1.3 MTT法檢測HClO對Ealy926細胞和HCT-8細胞增殖的抑制作用 將對數期生長的Ealy926細胞和HCT-8細胞按細胞密度5×103個/孔接種于96孔細胞培養板，終體積100μl，常規培養于37℃、5% CO2飽和濕度培養箱中。待24h細胞貼壁后，棄原培養液，分別將HClO溶液按50～800μmol/L的濃度梯度加入各組細胞中，終體積為100μl，空白對照組加入100μl不含血清的DMEM高糖培養基，各藥物濃度均設4副孔。干預10min后換成100μl含10%血清的DMEM高糖培養基。處理后的細胞培養24h后按MTT試劑盒說明書處理各組細胞，在酶聯免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值(OD)。實驗重復3次，計算細胞增殖率。細胞增殖率(%)=實驗組OD/對照組OD×100%。

1.4 Giemsa染色法觀察細胞形態學改變及凋亡、壞死情況 將對數期生長的Ealy926細胞和HCT-8細胞按細胞密度5×105個/孔接種于6孔細胞培養板，終體積2 000μl，常規培養于37℃、5% CO2飽和濕度培養箱中。待24h細胞貼壁后，棄原培養液。分別將HClO溶液按50～800μmol/L的濃度梯度加入各組細胞中，終體積為2 000μl，空白對照組加入2ml不含血清的DMEM高糖培養基，各藥物濃度均設3副孔。干預10min后換成2ml含10%血清的DMEM高糖培養基。處理后的細胞培養24h后，棄去原培養液，然后用PBS洗兩遍；按Giemsa染色試劑盒說明書處理細胞。于400×普通光學顯微鏡下觀察細胞形態學的變化并記錄拍照。

1.5 流式細胞術檢測凋亡細胞 將對數期生長的Ealy926細胞和HCT-8細胞按細胞密度5×105個/孔接種于6孔細胞培養板，終體積2 000μl，常規培養于37℃、5% CO2飽和濕度培養箱中。待24h細胞貼壁后，棄原培養液。分別將HClO溶液按50～800μmol/L的濃度梯度加入各組細胞中，終體積為2 000μl，空白對照組加入2 000μl不含血清的DMEM高糖培養基，各藥物濃度均設3副孔。干預10min后換成2 000μl含10%血清的DMEM高糖培養基。處理的細胞培養24h后，按照AnnexinV-FITC試劑盒說明書處理各組細胞。使用 BD FACS Calibur 流式細胞儀進行檢測，重復試驗3次。激發波長Ex=488nm；發射波長 Em=530nm。Annexin V-FITC 的綠色熒光通過 FITC(FLI)檢測；PI 紅色熒光通過 PI 通道(FL3)檢測。

1.6 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件對數據進行分析處理，組間差異比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩實驗組間采用獨立樣本t檢驗，P均<0.05 的檢驗標準表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HClO以濃度依賴的方式直腸癌HCT-8細胞增殖活力 MTT結果顯示(圖1)，采用不同濃度的HClO分別作用于各組細胞后， HClO濃度≤50μmol/L時對兩種細胞增殖的影響較小，HClO濃度≥100μmol/L時，兩種細胞的增殖率均明顯降低(**P均<0.01)呈劑量—效應關系。且直腸癌HCT-8細胞的增殖率明顯低于內皮細胞Ealy926的增殖率(#P均<0.05)。

圖1 不同濃度HClO對細胞增殖率的影響注：**與Control組相比，P均<0.01；#HCT-8與Ealy926相比，P均<0.05。

2.2 吉姆薩染色觀察HClO處理兩種細胞前后細胞形態學的變化及凋亡壞死情況 當HClO作用24h后，對照組細胞聚集生長，完全貼壁，生長良好，且具有清晰輪廓；50、200μmol/L HClO、組聚集連接減少，無明顯細胞形態的改變；400、800μmol/L HClO處理的實驗組細胞形態完全改變，出現細胞膜完整性的喪失、細胞核碎裂、細胞器變形等壞死現象。結果顯示，在HClO的作用下，內皮細胞Ealy926和直腸癌HCT-8細胞發生形態學改變，且細胞量減少，呈濃度—效應關系。見圖2、圖3。

圖2 不同濃度HClO作用下HCT-8細胞吉姆薩染色光學顯微鏡照片(400×，標尺20μm)注：A:Control組 B:HClO 50μmol/L組 C:HClO 100μmol/L組 D:HClO 200μmol/L組 E:HClO 400μmol/L組 F:HClO 800μmol/L組。

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡的結果 隨著HClO濃度升高，直腸癌HCT-8細胞和內皮細胞Ealy926的凋亡率也隨之升高，當HClO濃度>200μmol/L時，兩種細胞的實驗組與空白組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。且當HClO濃度為400μmol/L時，直腸癌HCT-8的死亡率明顯高于內皮細胞Ealy926(P<0.05)。凋亡率(%)=早期凋亡+晚期凋亡。見圖4。

圖3 不同濃度HClO作用下Ealy926細胞吉姆薩染色光學顯微鏡照片(400×，標尺20μm)注：A:Control組 B:HClO 50μmol/L組 C:HClO 100μmol/L組 D:HClO 200μmol/L組 E:HClO 400μmol/L組 F:HClO 800μmol/L組。

圖4 不同濃度HCIO作用下HCT-8和Ealy926細胞凋亡統計結果注：**與Control組相比，P均<0.01；#HCT-8與Ealy926相比，P均<0.05；##HCT-8與Ealy926相比，P均<0.01。

3 討論

CRC作為常見的疾病之一，對人體影響較大，具有全身轉移性，嚴重者造成患者死亡。而近年來的研究表明，高濃度的ROS可以阻滯細胞周期、誘導腫瘤細胞的凋亡和壞死。因此，合理利用ROS 濃度對腫瘤細胞的影響來進行腫瘤治療的方式成為近年來的熱點，通過調節機體內ROS的濃度，來誘導腫瘤細胞的凋亡[6]。體外評價藥物抑瘤作用可通過能否抑制細胞增殖率來體現。本實驗中，50μmol/L的HClO便可抑制直腸癌細胞HCT-8的增殖。本研究通過添加外源性類氧化劑HClO，使正常細胞與腫瘤細胞內的ROS增加，通過氧化應激誘導了內皮細胞Ealy926和直腸癌細胞HCT-8的凋亡。且直腸癌細胞對氧化劑HClO的敏感性強于內皮細胞Ealy926，一定濃度的氧化劑氧化損傷直腸癌細胞HCT-8的凋亡率明顯高于內皮細胞Ealy926。在800μmol/L HClO 干預的實驗組中，細胞出現明顯的細胞質泡沫化，可能是因為ROS過高導致內質網應激，破壞了細胞膜通透性，進而促進細胞死亡。

氧化策略在腫瘤中的應用尚存在爭議，但目前已經證實多種化療藥物都通過ROS途徑殺死腫瘤細胞。于正常的細胞，高濃度的ROS損傷脂質、蛋白質和DNA，這些氧化應激的積累則可能誘導癌變，而低濃度平衡狀態下的ROS對維持細胞正常生理功能具有重要作用[8]。因此還應注意ROS的升高能否達到對腫瘤的毒性閾值。本研究初步探討了HClO對內皮細胞Ealy926和直腸癌細胞HCT-8的影響，為深入研究外源性氧化劑誘導A549細胞凋亡以及出現細胞質空泡化的機制提供了新思路。