精索靜脈曲張對精子DNA碎片、活力、形態和體外受精結局的影響*

陳 康 吳妙峰 吳 品 蘇 斌 周錫環

廣東省惠東縣人民醫院泌尿外科 516300

精索靜脈曲張是一種導致男性不育的常見泌尿外科疾病，發病機制為靜脈回流受到阻礙或瓣膜失效后血液返流等致使精索內蔓狀靜脈叢呈現不同程度的擴張與迂曲，進而引發疾病[1]。在男性人群中，精索靜脈曲張的發病率通常達15%～20%，在原發性不育男性人群中，精索靜脈曲張的發病率通常達35%，在繼發性不育男性人群中，發病率高達80%。精子DNA碎片率(DFI)能夠反映出DNA的損傷情況，對精子DFI進行檢測可有效預測男性人群的精子功能狀況[2]。精子形態及精子活力可作為男性生育力評估參數，精子百分率可作為體外受精的預測參數。研究顯示，精索靜脈曲張能夠導致不育男性的精液質量顯著下降，并增加精子DNA碎片率，影響患者體外受精結局[3]。鑒于此，本研究旨在探討精索靜脈曲張對精子DNA碎片、活力、形態和體外受精結局的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究選取醫院2017年1月—2019年7月收治的60例精索靜脈曲張所致的男性不育患者作為觀察組，另選取同期的60例健康生育男性作為對照組。觀察組：年齡為20～48歲，平均年齡(31.52±5.23)歲；病程為2～18年，平均病程(5.31±1.22)年；位置：左側30例，右側22例，雙側8例；臨床分度：Ⅰ度18例，Ⅱ度22例，Ⅲ度20例。對照組：年齡為20～49歲，平均年齡(31.54±5.25)歲。本研究經醫院倫理委員會批準，且患者簽署了知情同意書。兩組患者的一般資料比較無差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入、排除標準 (1)納入標準：①經B超檢查后診斷為精索靜脈曲張患者；②同意進行研究者；③無外傷及遺傳性疾病史者。(2)排除標準：①合并生殖道感染者；②睪丸發育不良者；③合并嚴重心腦血管疾病者；④存在性功能障礙病史者。

1.3 方法

1.3.1 儀器與試劑：計算機輔助精子分析儀為法國IMV卡蘇的IVOSⅡ型號產品，顯微鏡為常州頂尖量具有限公司的JX6型號產品，恒溫水浴箱為北京天地首和科技發展有限公司的HWT-20B型號產品，移液器為四川芬蘭百得移液器生產廠家產品。主要使用試劑均來自于德國Merck公司及瑞典Vitrolife公司。

1.3.2 方法：(1)精液的收集與處理：患者應禁欲2～7d，通過手淫的方法對新鮮的精液進行收集，并置于杯內，收集完成后即時放置于37℃的恒溫水浴箱，完全液化后進行常規參數檢測；采用蘇木素—伊紅染色進行精子形態學分析。將剩余的精液用于檢測精子DNA碎片率。(2)精子染色質擴散實驗：①制片。將精液標本與人輸卵管培養液進行調配，濃度為5×106/ml；將1%低熔點的瓊脂糖融在90℃的水浴箱中，并在37℃恒溫箱中放置3min；將50μl的瓊脂糖和20μl的已稀釋精液進行混合；吸取20μl瓊脂糖—精液混合物，并滴至載玻片上，蓋上蓋玻片。將載玻片放置在4℃冰箱中5min，移走蓋玻片，將樣本保留待用。②DNA變性。將載玻片浸入至濃度為0.08mol/L的HCl溶液中，時間為8min；取出后再放入至中和裂解液Ⅰ中，時間為15min；放入至中和裂解液Ⅱ中，時間為5 min；放入至TBE緩沖液中，時間為2min；將載玻片放置在70%、90%和100%的乙醇溶液中進行脫水，時間分別為2min，取出后自然晾干待用。③染色。將瑞氏染液和PBS進行1∶1混合，于瑞氏染色10min后使用蒸餾水進行沖洗，自然風干。④結果判斷。在明視野顯微鏡下計數500個精子。(3)控制促排卵及體外受精：從前一次月經周期后的第21天起，將促性腺激素釋放激素激動劑(GnRHa)進行皮下注射，達到降調標準時再加用促性腺激素(Gn)對卵泡發育進行誘導，當主導卵泡直徑≥18mm時停用，晚上肌注10 000 IU的HCG， 36h后行穿刺取卵術。取卵當日行體外受精，于授精42h及72h對卵裂情況進行觀察。

1.4 觀察指標判定 精子DNA碎片率(DFI)=[(無光暈精子+小光暈精子+退化精子)/500]×100%；體外受精率=(受精胚胎數/獲卵數)×100%；卵裂率=(2PN卵裂數/體外受精數)×100%。依據Fernández標準進行分級：(1)大光暈：暈輪寬度和核心較小直徑相近或更大；(2)中光暈：暈輪寬度在大暈圈和小暈圈間；(3)小光暈：暈輪寬度和1/3核心較小直徑相似或更??；(4)無光暈精子；(5)退化精子；其中大光暈和中光暈精子為DNA完整精子，小光暈、無光暈及退化精子為DNA損傷精子。

2 結果

2.1 兩組精液的部分常規參數對比 與對照組比較，觀察組患者的精液量、正常精子形態率、精子濃度、圓形細胞數、前向精子活力均更低，比較具有顯著統計學差異(P< 0.05)。見表1。

表1 兩組精液部分的常規參數對比[M(P25，P75)]

2.2 兩組的精子DNA碎片率對比 與對照組相比，觀察組的精子DNA碎片率(DFI)、無光暈、小光暈、中光暈、大光暈、退化精子率均更高，比較具有顯著統計學差異(P< 0.05)。見表2。

表2 兩組的精子DNA碎片率對比

2.3 兩組體外受精率、卵裂率、優質胚胎率對比 與對照組相比，觀察組的體外受精率、卵裂率、優質胚胎率均更低，其中體外受精率、卵裂率比較具有顯著統計學差異(P< 0.05)，優質胚胎率比較無顯著統計學差異(P>0.05)。見表3。

表3 兩組體外受精率、卵裂率、優質胚胎率對比

3 討論

精索靜脈曲張是由于精索內的蔓狀靜脈叢回流受到阻礙或瓣膜失效后引發的血液淤滯現象，致使蔓狀靜脈叢出現迂曲、伸長及擴張等，導致精索靜脈曲張的形成。在男性不育患者中，精索靜脈曲張的發生率較高，對男性的生育能力造成了嚴重的影響，因此越來越受到臨床的重視，但臨床尚未完全明確關于精索靜脈曲張致使男性不育的確切機制[4]。精索靜脈曲張和睪丸體積下降具有密切的關系，且精索靜脈曲張能夠導致男性不育患者睪丸功能下降[5]。精索靜脈曲張引發睪丸出現局部缺氧，增強了無氧酵解，將ATP分解成次黃嘌呤，在黃嘌呤氧化酶的作用下生成具有損害性的細胞活性氧族，通過對氧化/還原動態的平衡進行破壞，誘發生精細胞出現凋亡，使精子數量較少，形態發生異常及增加了不成熟的精子數量[6]。過量的精子細胞活性氧能夠直接作用于生精細胞，并使DNA鏈出現斷裂，對DNA的完整性造成破壞，損傷生精細胞，引發不育[7]。精子形態異常及精子活率異常等精液質量異?？煞从吵鼍拥陌l育障礙情況。研究顯示，精索靜脈曲張能夠降低前向精子活力率及正常形態精子率，并增加DFI[8]。

本試驗研究結果顯示出，觀察組的精液量、正常精子形態率、精子濃度、圓形細胞數、前向精子活力均明顯低于健康男性組，且觀察組的精子DNA碎片率、無光暈、小光暈、中光暈、大光暈、退化精子率均明顯高于對照組，比較差異顯著(P< 0.05)。陶萍的研究結果證實[9]，伴精索靜脈曲張的不育患者的射精量、精子密度、前向活動精子百分率、正常形態精子率均明顯下降，與本研究結果基本一致。結果說明：精索靜脈曲張使男性不育患者的精子DNA碎片率增加，降低了患者的精子活力、形態率。分析原因可能為：(1)精索靜脈曲張患者精液中的精子細胞活性氧過度生成，加之抗氧化的機制發生缺陷，進而易導致精子DNA斷裂[10]。由于過量的精子細胞活性氧啟動了細胞膜脂質的過氧化，進而生成了大量的脂質過氧化物，對精子質膜進行攻擊，致使生精細胞及精子DNA單鏈、雙鏈發生斷裂，破壞了精子DNA的完整性[11]。(2)精索靜脈曲張伴男性不育患者的精子線粒體功能低于正常生育的健康男性[12]。精子的活力與精子的線粒體功能密切相關，精子的前向活動百分率直接取決于精子的線粒體功能高度，精子線粒體的數量及功能下降均會導致患者的精子活力下降[13]。

胡少軍等的研究中曾報道[14]，伴精索靜脈曲張的不育患者的DFI高于正常生育男性；而本研究結果還顯示，觀察組的體外受精率、卵裂率明顯低于同期患者，比較差異顯著(P<0.05)；與梁泳娜等的研究報道基本相符合[13]。結果說明：精索靜脈曲張降低了患者的體外受精率、卵裂率。分析其可能機制為：精索靜脈曲張患者精液中存在過量的精子細胞活性氧，其利用脂質過氧化對精子的DNA完整性產生破壞，精子DNA碎片增加后導致精子的染色質結構變得不穩定，在受精過程中的去濃縮步驟中，染色質纖維蛋白以二硫鍵的結合方式進行重新排列，雖增加了染色質結構穩定性，但對精卵結合時精子染色質原核的形成產生影響，進而影響患者的體外受精，導致體外受精率及卵裂率降低[15]。

綜上所述，精索靜脈曲張可增加男性不育患者的精子DNA碎片率，降低體外受精率及卵裂率，同時下降了精子的活力、形態率，影響男性不育患者的受精結局。