物理誘變技術及其在香蕉育種中的研究進展

王安邦，龔德勇，許 奕，李羽佳，王甲水，臧小平，井 濤，李敬陽*

(1.中國熱帶農業科學院海口實驗站/海南省香蕉健康種苗繁育工程技術研究中心， 海口 571101; 2.貴州省農業科學院亞熱帶作物研究所， 興義 562400)

香蕉為芭蕉科(Musaceae)芭蕉屬(Musa)植物，是世界重要的糧食作物,也是貿易量及消費量最大宗的水果。我國是世界產蕉大國，據聯合國糧農組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)統計，2017年我國香蕉收獲面積約38.13萬公頃，產量1 142.3萬噸，收獲面積和總產量分別位居全球第6和第2位，香蕉產業已成為我國南亞熱帶地區農民脫貧致富的重要支柱產業。但是，由于香蕉枯萎病不斷蔓延，病蟲害、寒害對生產的影響日趨嚴重，農民種蕉積極性受到挫傷，香蕉產業遭受嚴重沖擊，培育高產、抗寒、抗病能力較強的優良香蕉栽培品種顯得極為迫切。香蕉主栽品種多為三倍體，高度不育及常規育種存在周期長、人力財力消耗大等特點，常規育種方法在選育優質高抗香蕉品種方面困難重重，而物理誘變方法因其突變率高、后代變異范圍廣、變異類型多等特點成為選育高抗優質香蕉品種新的重要突破技術。本文綜述了物理誘變技術及其在香蕉育種中的研究進展，包括物理誘變定義、種類及應用等方面，以期對香蕉誘變研究及新品種選育實踐提供參考。

1 物理誘變育種的定義、技術種類和優勢

1.1 物理誘變育種的定義

物理誘變育種是指用物理因素誘導動植物的遺傳特性發生變異，再從變異群體中選擇符合人們某種要求的單株/個體，進而培育成新的品種或種質的育種方法。主要機理是通過高能電子或帶電粒子把能量傳遞給靶物質DNA，導致生物體合成被抑制，DNA分子損傷(包括堿基脫落、堿基破壞、二聚體形成等)，DNA雙鏈斷裂，從而引起生物體通過損傷修復而產生遺傳性變異[1]。主要的誘變源有X射線、γ射線、中子、微波、激光、離子束等。

1.2 物理誘變育種的技術種類

1.2.1 離子束誘變育種

離子束誘變育種是將離子束注入植物的種子、細胞或其他器官等，誘發植物遺傳性產生改變，獲得多種多樣的突變個體，進而選育出植物新品種或新種質的育種方法。離子束注入分為高能離子束和低能離子束兩種。

與傳統的X、γ射線相比，相同劑量輻照下，離子束具有更高的相對生物學效應(relative biological effectiveness,RBE),其作用于植物體后可獲得比自然變異率高1 000倍以上的突變率和較廣的突變譜[2,3]。離子束具有特殊的Bragg峰，其傳線能密度先隨射程的增加而逐漸遞增，在其射程末端形成一個尖銳的Bragg峰，然后逐漸遞減，這樣使得生物體只是在峰值處損傷較大，在其他區域的損傷較輕，因而在保證存活率的同時可獲得較多的有利突變[4，5]。另外，離子在固體內的直進性很好，可以通過調節電場和磁場的強弱控制入射深度，用來進行定點定位誘變研究,因而具有一定的可重復性，可作為探索定向育種的新技術[2]。

離子束誘變育種已經在其他農作物誘變育種研究中取得重要進展。安徽省農科院水稻所與中國科學院等離子體物理研究所在將離子束生物技術運用到水稻誘變育種方面進行了合作研究，利用離子束誘變技術成功選育出了7個水稻新品種并通過了審定，累計推廣種植面積達100多萬公頃[6]。采用16O和12C離子對春小麥種子進行輻射處理，成功選育出具有高產、矮稈等特點的水地春小麥“隴輻2號”[7]。大豆、五葉茄、板栗、葡萄、西瓜、甜瓜、甜菜、玉米、茶樹、甘薯和谷子等作物的離子束誘變育種也取得了進展[2]。

1.2.2 等離子體誘變育種

相對離子束注入需要真空環境，常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)誘變因操作環境簡單等原因逐漸受到熱捧。常壓室溫等離子體能夠在大氣壓下產生溫度在25～40 ℃之間的、具有高活性粒子(包括處于激發態的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等)濃度的等離子體射流。等離子體射流可使活性粒子透過細胞膜作用于DNA物質，引起基因損傷，細胞中的DNA不完全修復形成遺傳穩定的突變[9]。

常壓室溫等離子體具有射流溫度低(可室溫操作)、所產生的等離子體均勻、對操作人員安全、操作簡便、成本低廉、突變型的多樣性高等優點，已廣泛應用于微生物誘變育種中[10]，并逐漸運用于植物誘變育種中。周筑文等[11]利用常壓室溫等離子體處理番茄種子，結果表明等離子體處理的7個組產量、單果重等指標均超過對照，其中5個組的植株抗病性增強。趙東曉等[12]發現胡麻不同品種對常壓室溫等離子體處理反應存在差異，ARTP處理可以促進天亞10號在NaCl脅迫下種子萌發和幼苗生長，降低質膜相對透性、葉綠素含量、類胡蘿卜素含量、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量，提高過氧化物酶(peroxidase,POD)活性及可溶性蛋白含量；但抑制了隴亞13號在NaCl脅迫下種子萌發和幼苗生長，增加了質膜相對透性、葉綠素含量、類胡蘿卜素含量、MDA含量，降低了POD活性及可溶性蛋白含量。另外，大豆[13]、小麥[14]、玉米[10]等作物也開展了ARTP誘變研究。

1.2.3 中子誘變育種

中子按能量大小分為超快中子、快中子、中能中子、慢中子、熱中子。輻射育種中應用較多的是熱中子和快中子[15]。快中子是在核反應中，未經過慢化劑慢化的中子。快中子可使A-T，C-G之間的氫鍵斷裂；在1或2個DNA鏈中，糖與磷酸基之間發生斷裂；同一DNA上相鄰胸腺嘧啶之間形成二聚體；DNA鏈斷裂和交聯[16]。

快中子是一種高能量輻射源，是非常有效的誘變劑，具有誘發突變頻率高、誘變范圍廣、丟失片段小、危害小等特點。劉忠祥等[17]采用252Cf裂變中子源(0.46～4.19 Gy)輻照玉米自交系LY8405和PH6WC種子，結果發現低吸收劑量的中子輻照抑制了自交系LY8405的出苗率，促進了自交系PH6WC的出苗率，初步認為2.00～4.19 Gy的輻照劑量是玉米252Cf裂變中子輻照處理的適宜劑量。徐大鵬等[18]發現中子輻照豌豆干種子后，可延遲M1代豌豆開花時間，升高出苗率，促進苗期分支增多，顯著提高M1代豌豆的收獲量。快中子輻射效應的研究在谷子[16]、小豆[19]、紫花苜蓿[20]、花生[21]、禾草[22]、棉花[23]、水稻[24]、小麥[25]等作物中已取得較好的進展。

1.2.4 激光誘變育種

激光是一種與自然光不同的輻射光，具有高光亮性、高單色性、高方向性和高相干性。激光通過光效應、熱效應、壓力和電磁效應的綜合作用，能使生物的染色體斷裂或形成片斷，甚至易位和基因重組[26]。

2.3.4模式優點該治理模式適用范圍廣，對穩定、半穩定溝底比降小于10%，坡度較小的侵蝕溝有很好的治理效果；可與林業造林有機結合，能提高植被覆蓋率，改善生態環境；原料豐富，成本較低，經濟效益顯著，能增加農民收益。

激光誘變育種技術與常規育種相比，具有高效、穩定、高選擇性、回復突變率低、定向變異率高、輻射損傷率輕、當代變異、無污染等優點，且激光還可以促使作物增產、提高植物的光合作用、根尖有絲分裂頻率等生物效應的發生，所培育出的新品種均具有高產、優質、適應范圍廣、抗病能力強等特性[27]。但由于受激光高強單向特性且激光透過率低的限制，不能夠進行大面積的輻照。為解決此問題，近年來，我國科研工作者進行了激光與靜電場、脈沖電場和電暈相結合的育種技術研究，并取得了可喜的成果[28]。

焦順吉[29]利用飛秒激光輻照水稻，結果發現對水稻產量有促進影響的最佳輻照時間為5 s處理，在11 s和13 s處理中還得到了早熟和長芒變異株。通過激光誘變方法也選育出洋蔥新品種：西蔥1號、西蔥2號、西蔥3號及西蔥4號[30]。據不完全統計，目前我國采用激光誘變育種技術已在水稻、小麥、棉花、玉米、大豆、油菜、蠶豆、瓜果、蔬菜、牧草、中藥材以及桑蠶等20多種農作物上選育成功，其中大面積推廣的新品種已有100多個[26]。

1.2.5 復合誘變育種

不同誘變方法都有其自身突變域的局限性，單一誘變方法往往難以達到預期效果，采用2種及其以上的誘變方法，即復合誘變法，有利于拓展突變譜、增加突變頻率、提高正突變率[31]。復合誘變既可以是2種物理誘變方法的復合，也可以是物理誘變法與化學誘變、生物誘變等方法配合使用。復合誘變使用方式包括：兩種或多種誘變劑的先后使用，同一種誘變劑的重復作用和兩種或多種誘變劑的同時使用。普遍認為，復合誘變具有協同效應，如果兩種或兩種以上誘變劑合理搭配使用的復合誘變較單一誘變效果好[32]。

河南省科學院同位素研究所用矮抗58干種子經航天誘變篩選的SP4代優異材料“豫同198”為母本，以高產親本周麥18為父本雜交，同時F0代采用250 Gy劑量60Co-γ射線輻照處理后按系譜成功選育出半冬性中早熟小麥新品種-“豫豐11”。該品種于2018年通過國家審定，并已申報國家植物新品種權保護。“豫豐11”的成功選育，說明航天誘變和60Co-γ射線輻照與傳統雜交相結合可加速創制優異育種材料和培育新品種[33]。

1.3 物理誘變育種的優勢

物理誘變能夠有效的誘變產生不同的基因突變，創造出作物新性狀和新類型，為作物的品種選育提供豐富的材料。物理誘變育種具有以下優勢：1)提高突變率，擴大“變異譜”，創造新性狀和新類型；2)改良某些單一性狀，誘導點突變；3)育種程序簡單，后代穩定快、育種年限較短；4)打破性狀連鎖，促進基因重新組合，提高重組率[34]。另外，物理誘變育種只是加速了變異的遺傳范圍和種類，同自然界的變異沒有本質的區別[35]，可以打消消費者對新品種安全性的顧慮。

2 物理誘變在香蕉育種中的應用

香蕉輻射誘變始于20世紀60年代，早期研究多以野生蕉種子或栽培種的塊莖進行輻射誘變處理，然后比較不同輻射劑量對成活率及變異率的影響[36]。1961年臺灣用吸芽作試材，2.5 kR劑量輻射的成活率達70%，但植株無變異。1964年臺灣用組培外植體輻射，獲得矮化、豐產突變體，同時出現莖、葉、芽的形態和色澤等性狀變異現象[37]。目前，用于香蕉育種的物理誘變技術主要是γ射線。

2.1 γ射線在香蕉育種中的應用

γ射線屬于能量高、穿透力強的短波長電離輻射，可導致脫氧核糖的堿基氧化或化學鍵斷裂，其電離輻射也可使原子或分子相互作用產生自由基，引起DNA缺失和損傷，還能引起染色體畸變、缺失、易位和倒位等。

確定γ射線在香蕉育種中的有效劑量范圍可以以較小的代價獲得理想的突變體，是γ射線誘變育種的關鍵步驟。郭建輝等[38]利用60Co-γ射線對天寶香蕉試管芽進行輻照試驗，結果表明試管芽材料大小不同對γ射線所表現出的敏感性有顯著差異，其中以2.0～5.0 mm 1/2縱切芽體最敏感，其次是2.0～5.0 mm芽，而5.0～10.0 mm芽最不敏感，它們的半致死劑量(LD50)分別是49.299 Gy、57.431 Gy和68.191 Gy。李豐年等[39]以高腳頓地雷6個香蕉品種的6代分化芽和7代生根苗為試驗材料進行60Co-γ射線輻照試驗，結果發現照射量12 kR(照射量率66.0 R/m)/8 kR(193.6 R/m)分別是香蕉組培分化芽與生根苗的致死劑量，6 kR(50.2 R/m)至8 kR(35.0 R/m)是香蕉分化芽輻射育種的適宜劑量范圍。葉春海等[40]以香蕉組培分化芽和生根苗為試驗材料，以劑量率60 R/m的60Co不同劑量輻射處理，選育大果、高產、中矮桿的香蕉新品種，結果表明在劑量率為60 R/m條件下3～6 kR應是香蕉組培苗育種的適宜范圍。張建斌等[41]發現帶皿香蕉組培分化芽在60Co-γ射線的輻射劑量為5 kR時，分化芽成活率和生根苗成活率分別為35.5%、25.1%，獲得的有益性狀突變率也最高，認為以劑量率60 R/m、輻射劑量5 kR處理，可能是帶皿香蕉不定芽輻射誘變育種的最佳選擇。

國內外香蕉育種專家除了對輻射劑量的研究，更多著眼于通過γ射線誘變技術培育香蕉新品種。Novak等[42]通過輻射誘變篩選得到香蕉早花突變體，經過進一步篩選獲得香蕉早熟品種“Novaria”。Alves[43]通過輻射誘變品種“Nanicao”獲得具有較高耐鹽性的突變體。Matsumoto等[44]用γ射線(2 kR)誘變類圓球體(protocorm-like body)獲得了1株比原始株具有更高耐鋁抗性的突變體。在印度將香蕉細胞懸浮體系和輻射誘變育種相結合，培育出抗枯萎病1號生理小種的香蕉新品種“Maca”[45]。葉春海等[40]以香蕉組培分化芽和生根苗為試驗材料，以劑量率60 R/m的60Co不同劑量輻射處理，初步獲得了一批植株健壯、產量高、生長發育較快的株系。郭建輝等[38,46,47]對香蕉離體試管芽進行60Co-γ射線輻射處理，從中選育出果穗外觀較好、增產顯著的“漳蕉8號”新品種，并進行過氧化物酶同工酶和RAPD(random amplified polymorphic DNA)分析，結果表明“漳蕉8號”中與POD有關的基因可穩定遺傳與表達，在DNA多態性水平上也表現出明顯的差異。Smith等[48]在2006年用γ射線輻射誘導“Dwarf Parfitt”，使其產量增加和果實變大，同時具有了一定的抗枯萎病能力。Bermudez-Caraballoso等[49]利用劑量為25 Gy的60Co-γ射線誘變香蕉分化芽，獲得98個矮化突變體，通過田間試驗會進一步驗證這些突變體。Pestana等[50]利用劑量為30 Gy的60Co-γ射線誘變品種“Preciosa”(AAAB)，結合株高、早花、果穗重等農藝性狀觀測和ISSR(inter simple sequence repeat)分子標記技術，篩選到4個矮化、農藝性狀優良的突變體，并繼續田間試驗驗證這些突變體。王安邦[51]利用香蕉未成熟雄花誘導愈傷組織和芽體作為外植體，利用40、60、70、80、100 Gy 5種輻射劑量60Co-γ射線進行誘變，并結合梯度低溫定向篩選，初步獲得了62株在表型上表現出良好抗寒能力的植株，同時利用SSR(simple sequence repeats)分子標記技術證明了部分突變體在DNA水平上存在明顯差異。張建斌等[41]利用60Co-γ射線誘變帶皿香蕉組培分化芽，初步獲得了一些植株健壯、梳形整齊、產量高、抗枯萎病能力強、抗旱、抗寒的株系，并進行進一步的選育研究。

另外，根據聯合國糧農組織(FAO)和國際原子能機構(International Atomic Energy Agency,IAEA)統計，截止2019年8月只有3個香蕉突變品種登記在突變品種數據庫(mutant variety database,MVD)中，其中泰國品種“Klue Hom Thong KU1”1985年登記入庫，通過25 Gy γ射線輻照分化組織獲得，主要突變性狀是有較大的果穗，還有前文提到的馬來西亞早花品種“Novaria”,1995年登記入庫，最后一個是蘇丹突變品種“AL-BEELY”,2007年登記入庫，是一個產量提高30%的突變品種。

值得一提的是，中國熱帶農業科學院金志強課題組的“香蕉輻射誘變及定向育種新技術”成果，獲得2018年海南省技術發明獎一等獎，這是對60Co-γ射線誘變技術運用在香蕉選育種研究中取得不菲成果的肯定。

2.2 空間誘變育種

空間誘變育種又稱太空誘變育種、航天誘變育種，是指利用返回式衛星、飛船、航天飛機、高空氣球等航天器把植物種子送到太空，利用太空中的特殊環境(包括太空輻射、微重力、高真空、超低溫、弱地磁等因素)，誘導植物種子產生變異，然后返回地面選育植物新品種的育種技術[52]。20世紀60年代，前蘇聯首先進行了空間育種的嘗試，1984年美國用太空飛行器承載番茄種子在太空飛行6年后取回，選育出了變異的番茄。我國是第三個成功進行了太空育種的國家，已經在棉花、小麥、水稻、花生、番茄、青椒、茄子、芝麻等作物上誘變培育出一系列優質、高產、抗病、早熟的農作物新品種和新種質，其中通過國家或省級品種審(認)定的作物品種總數達到110個[53,54]。空間誘變致使作物遺傳變異的原因尚不完全清楚，一般認為空間誘變的主要因素有微重力假說、空間輻射假說和轉座子假說。

空間誘變后代變異頻率較高，變異幅度大，有益突變多，極少發生生理突變，變異性狀穩定快，難退化，育種周期縮短，且容易育成產量與質量都有明顯提高的優秀新種質[55]。但由于航天技術的特殊性，搭載材料、誘變時間以及搭載量受到明顯限制，因而香蕉空間誘變育種的相關研究還不多。2016年中國熱帶農業科學院王靜毅將香蕉愈傷組織搭載在我國首顆微重力科學實驗衛星“實踐十號”成功送上太空，目前發現植株矮化、顏色變異等突變體，正繼續進行大田試驗驗證這些突變體。

3 總結與展望

目前香蕉物理誘變育種研究大多數集中在γ射線誘變，而近年來，物理誘變技術發展日新月異，離子束、等離子體、中子等作為新型的誘變源開始應用于植物誘變育種中，它們可以在相對低劑量下誘變植物，使植物發生較高的突變率但又不影響植物其它生理特征[56,57]。相比其他作物，香蕉物理誘變育種的研究相對滯緩且新興物理誘變技術尚未應用，今后應加強離子束、等離子、中子及激光等新型誘變源的應用研究，特別是我國預計在2022年前后建成長期在軌運行的載人空間站，這對加強香蕉空間誘變育種及突變體分子機理研究十分有利。

誘變材料選擇也是物理誘變育種研究的重要方向之一。栽培品種的香蕉高度不育，極少有有活力的種子可以用于物理誘變育種，因而多采用愈傷組織作為誘變材料，導致產生的突變體存在嵌合體，需要通過組培和田間鑒定相結合的方式不斷進行篩選，事倍功半。采用胚性細胞懸浮體系作為誘變材料可以有效的解決上述問題，所以如何建立穩定的香蕉胚性細胞懸浮體系用于物理誘變也將成為香蕉物理誘變育種的一個重要研究方向。此外，現有的香蕉轉基因體系存在轉化效率低、嵌合體多等問題，而離子束介導轉基因技術具有可控性，可以精準的控制外源基因轉移通道的深度，從而具有較高的轉化效率和一定的重復性，因此利用離子束介導轉基因技術建立香蕉轉基因體系將成為未來香蕉研究的熱點。

目前香蕉誘變育種對突變體篩選研究多集中于田間農藝性狀的觀察和生理生化指標的檢測上，對如何高效篩選突變體以及突變體變異的分子機制研究有待進一步探究。可喜的是，Datta等[58]對輻射誘變篩選得到的香蕉早熟突變品種‘Novaria’進行了低覆蓋率全基因組測序(low-coverage whole-genome sequencing,LC-WGS)，發現其存在30萬到380萬堿基對大小不一的多個基因片段缺失，并利用組培技術和低覆蓋率全基因組測序技術相結合的方式建立一套篩選突變體的體系。相信隨著香蕉A基因組[59]和B基因組[60]測序完成，香蕉基因組、轉錄組和蛋白質組數據庫將逐漸完善，利用高通量測序、轉錄組以及蛋白質組技術對物理誘變獲得的變異材料開展系統性研究來闡明物理誘變的遺傳和分子機理將是今后研究的熱點。

另外，選育突變體時對株高、早熟、高產和抗性等容易觀察發現的突變性狀有著更多的關注，對果實品質改良方向的關注度比較少，例如香蕉已成為減肥人士所鐘愛的熱門水果，因而香蕉抗性淀粉含量的多少也可作為香蕉選育種的方向；我國也缺少適合用于制作加工香蕉產品所需的高糖高酸的加工專用型品種。而且我國尚未在MVD登記香蕉突變品種，這對我國香蕉新品種走出去和擴大國際影響有著不利影響。不過相信隨著我國科研人員的不斷探索，香蕉物理誘變育種研究將有嶄新的局面。