舒芬太尼對心肌缺血再灌注大鼠心肌細胞凋亡及Bcl-2、LC3Ⅱ、Beclin-1表達的影響

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)是指心肌缺血后重新獲得血液灌注而引起的，以心律失常、心肌頓抑、心肌梗死面積擴大等為主要表現的功能障礙及結構損傷性疾病[1]。MIRI好發于冠狀動脈支架植入手術、急性心肌梗死溶栓等治療后，是制約心血管阻塞性疾病再通后療效的主要因素之一[2]。近年來，隨著生活水平改變和人口老齡化進展，我國心血管疾病的發生率不斷增加，據統計，我國目前約有2.9億心血管疾病病人，死亡率占死亡構成的40%以上[3]，高于腫瘤及其他疾病，居于首位。使缺血的心肌盡快恢復灌注是治療心血管疾病的主要方向，但MIRI的存在又嚴重影響治療效果，故采取措施減輕MIRI對于心血管疾病的治療有重要意義。目前，臨床上對于MIRI仍無特效治療方案，有研究認為，阿片類藥物對于器官缺血再灌注損傷有明確的保護作用[4]。舒芬太尼是臨床常用的阿片類麻醉劑之一，也可以拮抗MIRI[5]，但具體的作用機制尚未完全明確。本研究探討舒芬太尼對心肌缺血再灌注大鼠心肌細胞凋亡及微管相關蛋白1輕鏈3Ⅱ(LC3Ⅱ)、Beclin-1表達的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 6～7周齡SPF級健康雄性SD大鼠52只，體重200～260(231.37±17.63)g，動物許可證號：生產許可SCXK(滬)2017-0003，由中國人民解放軍第二軍醫大學(實驗動物中心)提供。所有大鼠分籠適應性飼養，飼養室內安靜、通風，溫度設定為20～25 ℃，濕度控制在50%～70%，晝夜節律為12 h，大鼠自由活動并攝入標準飼料、滅菌水，定期更換墊料、清掃飼養室、消毒。

1.1.2 主要藥品與試劑 枸櫞酸舒芬太尼注射液，規格：每支50 μg，批號：20170223，購自宜昌人福藥業有限責任公司；3-甲基腺嘌呤(3-MA)，規格：每瓶50 mg，純度98%，CAS號：5142-23-4，貨號：Z-DLM-7471-PK-50MG，購自上海甄準生物科技有限公司。10%水合氯醛，購自成都普濟醫藥化工有限公司；肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)酶聯免疫吸附(ELISA)法試劑盒，購自齊一生物科技(上海)有限公司；RIPA組織細胞快速裂解液(含苯甲基磺酰氟)，購自北京泰澤瑞達科技有限公司；二喹啉甲酸法(BCA)法蛋白定量試劑盒，購自上海澤葉生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE凝膠)制備試劑盒、聚偏二氟己稀膜(PVDF膜)，購自金克隆(北京)生物技術有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(TBS)緩沖液，購自武漢賽維爾生物科技有限公司；B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2關聯X蛋白(Bax)、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG，購自美國CST公司；超敏化學發光底物(ECL)試劑盒，購自上海喬羽生物科技有限公司；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記測定法(TUNEL法)細胞凋亡試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑，購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.1.3 主要儀器設備 SAR-830小動物呼吸機，美國CWE公司產品；LS-20ECG動物心電圖記錄分析儀，北京拜安吉科技有限公司產品； Heraeus biofuge 22R型離心機，德國Heraeus公司產品；酶免之星E-STAR 4CH全自動酶免分析儀，瑞士Asubio公司產品；SPIFE 3000型全自動電泳儀，美國Helena公司產品。

1.2 方法

1.2.1 造模及實驗方法[6]所有大鼠適應性飼養時間為5 d，結束后，按隨機數字表法將所有大鼠分為對照組、模型組、3-MA組及舒芬太尼組，各13只。模型組、3-MA組及舒芬太尼組大鼠均建立心肌缺血再灌注模型，予以10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射以麻醉大鼠，之后將其仰臥位固定于鼠板上，氣管插管，連接小動物呼吸機及心電圖儀；在左側第四肋間取縱向切口，長度為1 cm，切開皮膚，逐層打開胸壁，暴露心臟，于動脈圓錐和左心耳間冠狀靜脈處，用6號普理靈不可吸收縫線結扎左冠狀動脈前降支；結扎后，心臟局部有發紺出現，心電圖ST段弓背抬高即為結扎成功，30 min后解開縫線，恢復灌注，心臟局部發紺區轉紅，心電圖弓背抬高的ST段回落即為再灌注恢復。對照組大鼠接受相同的手術操作，但不結扎冠狀動脈。

冠狀動脈結扎前30 min，3-MA組給予3-MA溶液20 mg/kg，尾靜脈注射；舒芬太尼組給予枸櫞酸舒芬太尼注射液3 μg/kg，尾靜脈注射；模型組、對照組分別給予等體積0.9%氯化鈉溶液，尾靜脈注射。整個過程中如有造模失敗或意外死亡的大鼠及時補充。

1.2.2 標本采集與處理[7]心肌再灌注2 h后，打開大鼠腹腔，自腹主動脈取血2 mL，靜置30 min，采用離心機以3 000 r/min速度離心15 min，分離血清，置于-20 ℃冰箱內保存備檢；之后完整摘取心臟，采用預冷的生理鹽水洗去殘血，于冰上切取左冠狀動脈供血區心肌組織，取其中1/2心肌組織，4%甲醛固定4 h，經梯度濃度乙醇脫水、二甲苯透明后，常規采用石蠟包埋，切片，厚度為4 μm；剩余1/2心肌組織置于液氮內迅速冷凍，-80 ℃保存備檢。

1.2.3 ELISA法檢測血清心肌酶水平檢測 取1.2.2中制備的血清，迅速解凍，按照試劑盒說明書步驟，采用全自動酶免分析儀，通過ELISA法檢測血清CK、LDH、CK-MB水平[8]。

1.2.4 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡 取1.2.2中制備的心肌組織石蠟切片，常規二甲苯作用10 min脫蠟，依次采用100%、95%、95%、80%乙醇處理5 min水化，采用3%過氧化氫溶液處理10 min，PBS沖洗3 min×3次；按照試劑盒說明配制TUNEL檢測液并滴加在切片上，37 ℃濕盒內反應60 min，PBS沖洗3 min×3次；滴加DAB顯色劑，待顯色清晰時自來水沖洗結束顯色，常規85%、95%、100%梯度濃度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察TUNEL染色結果并進行拍照，在40×高倍鏡下選擇5個不重復視野，采用Image-Pro Plus 4.5圖像分析軟件統計凋亡細胞核數和細胞核總數，并根據凋亡指數(AI)=凋亡細胞核數/細胞核總數×100%，計算心肌細胞AI，取平均值[9]。

1.2.5 Western Blot法檢測大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達水平[9]取出1.2.2中冷凍保存的心肌組織40 mg，剪碎，加入RIPA組織細胞快速裂解液0.5 mL，采用透明玻璃勻漿器充分勻漿，轉移至EP管內置于冰上裂解30 min，以14 000 r/min速度低溫離心10 min，獲取上清液；按照BCA法蛋白定量試劑盒說明書中步驟，檢測上清液中總蛋白質含量；制備SDS-PAGE凝膠并固定于電泳儀上，每個蛋白樣品上樣20 μg，設定電泳條件為濃縮膠100 V、時間30 min，分離膠120 V、時間1 h，分離目的蛋白；將目的蛋白轉移至PVDF上，采用TBS緩沖液(5%脫脂奶粉)4 ℃搖床封閉過夜；洗膜，置于分別含有Bcl-2(1∶1 000稀釋)、Bax(1∶1 000稀釋)、LC3Ⅱ(1∶1 000稀釋)、Beclin-1(1∶1 000稀釋)蛋白抗體及1∶50稀釋的GAPDH(內參)3 mL的小槽內，室溫搖床孵育1 h；洗膜，置于含有3 mL HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋)的小槽內，室溫搖床孵育40 min；洗膜，在暗室內，按照ECL試劑盒說明進行化學發光、顯影、定影，晾干膠片；掃描膠片，采用Image-Pro Plus 6.0凝膠圖像處理系統進行分析，確定目的蛋白條帶的光密度值，計算心肌組織Bcl-2、Bax、LC3Ⅱ、Beclin-1相對表達量以及Bcl-2/Bax比值。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清CK、LDH、CK-MB水平比較 與對照組比較，其他各組大鼠血清CK、LDH、CK-MB水平均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，3-MA組和舒芬太尼組大鼠血清CK、LDH、CK-MB水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；舒芬太尼組大鼠血清CK、LDH、CK-MB水平低于3-MA組，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

組別只數CK(×102 U/L)LDH(×102 U/L)CK-MB(ng/mL)對照組1315.37±2.1111.45±1.530.21±0.03模型組1332.49±4.18①28.64±3.85①1.73±0.24①3-MA組13 26.44±3.36①② 21.18±3.02①② 0.56±0.06①②舒芬太尼組13 23.65±3.02①②③ 16.83±2.16①②③ 0.38±0.05①②③F值62.10588.651381.387P0.0000.000 0.000

與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05；與3-MA組比較，③P<0.05。

2.2 各組大鼠心肌組織AI比較 TUNEL法檢測結果顯示，光鏡下，正常心肌細胞的細胞核呈藍色，而凋亡陽性細胞的細胞核被染成棕褐色，且細胞核固縮，各組心肌凋亡陽性細胞數量存在差異(見圖1)。與對照組比較，各組大鼠心肌組織AI升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，3-MA組和舒芬太尼組大鼠心肌組織AI降低，差異有統計學意義(P<0.05)；且舒芬太尼組大鼠心肌組織AI低于3-MA組，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

注：A為對照組；B為模型組；C為3-MA組；D為舒芬太尼組。

組別只數AI對照組132.48±0.32模型組1338.74±5.17①3-MA組13 23.36±3.06①②舒芬太尼組13 17.25±2.39①②③F值279.667P0.000

與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05；與3-MA組比較，③P<0.05。

2.3 各組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白、Bax蛋白表達水平比較 與對照組比較，各組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白、Bax蛋白表達水平升高，Bcl-2/Bax比值降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，3-MA組和舒芬太尼組大鼠心肌組織Bax蛋白表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)，且舒芬太尼組大鼠心肌組織Bax蛋白表達水平低于3-MA組，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，3-MA組和舒芬太尼組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白表達水平及Bcl-2/Bax比值升高，差異有統計學意義(P<0.05)，且舒芬太尼組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白表達水平及Bcl-2/Bax比值高于3-MA組，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表3、圖2。

組別只數Bcl-2蛋白Bax蛋白Bcl-2/Bax對照組130.33±0.040.18±0.021.83±0.12模型組130.42±0.06①0.63±0.08①0.72±0.09①3-MA組13 0.61±0.08①② 0.37±0.05①② 1.64±0.22①②舒芬太尼組13 0.68±0.05①②③ 0.29±0.04①②③ 2.17±0.31①②③F值97.608175.043119.714P0.000 0.000 0.000

與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05；與3-MA組比較，③P<0.05。

注：A為對照組；B為模型組；C為3-MA組；D為舒芬太尼組。

2.4 各組大鼠心肌組織LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達水平比較 與對照組比較，各組大鼠心肌組織LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，3-MA組和舒芬太尼組大鼠心肌組織LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)，且舒芬太尼組大鼠心肌組織LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達水平低于3-MA組，差異有統計學意義(P<0.05)。 詳見表4、圖3。

表4 各組大鼠心肌組織LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達水平比較(±s)

與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05；與3-MA組比較，③P<0.05。

注：A為對照組；B為模型組；C為3-MA組；D為舒芬太尼組。

3 討 論

血運重建是恢復冠心病病人心肌血供的重要手段，而MIRI不僅影響治療效果，而且可加重心肌細胞損傷、壞死，是冠心病治療中亟待解決的問題之一。MIRI是多種因素共同作用的結果，發病機制十分復雜，目前常見的有氧化應激反應介導心肌細胞凋亡和心肌損傷、細胞內和線粒體鈣離子超載、生理pH值迅速恢復致心肌細胞過度攣縮、線粒體膜通透性轉換孔開放致三磷酸腺苷缺失和細胞死亡[10]等。近年來研究發現，細胞自噬在MIRI的發生過程中具有重要作用，生理狀態下的細胞自噬有助于改善能量代謝維持細胞穩態，而過度自噬則會加速必要蛋白質、細胞器等降解，引起細胞功能障礙、死亡[11]。Tsai等[12]研究發現，自噬抑制劑3-MA能在體外抑制心肌細胞死亡，也側面證實了自噬能誘發心肌細胞死亡這一觀點。因此，細胞自噬也可能是減輕MIRI的作用靶點之一。關于減輕MIRI的策略，目前主要包括缺血預適應、缺血后處理、遠程缺血預適應、藥物干預等，其中藥物干預適用性最強。

本研究采用左冠狀動脈結扎法建立缺血再灌注大鼠模型，并于結扎前分別采用3-MA、舒芬太尼干預大鼠，以探討舒芬太尼對MIRI的影響及作用機制。舒芬太尼為臨床廣泛應用的阿片類麻醉藥物，具有較好的鎮靜、鎮痛作用，醫學界關于其在MIRI中的作用已經有了一部分研究。劉祥等[13]研究認為，舒芬太尼可能通過激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶(Akt)信號通路來減輕大鼠MIRI，起到保護心肌的作用。常健[14]則發現，舒芬太尼對一氧化氮、超氧化物歧化酶等氧化應激相關指標有調節作用，并因此減輕了MIRI大鼠的心肌損傷程度。以上研究均證實舒芬太尼具有心肌保護作用，但具體的作用機制尚未有定論。本研究結果顯示，與模型組比較，3-MA組和舒芬太尼組大鼠血清CK、LDH、CK-MB水平降低，且舒芬太尼組大鼠血清CK、LDH、CK-MB水平低于3-MA組，CK、LDH、CK-MB均為評估心肌損傷的敏感指標，可用于判斷MIRI程度，該結果再次證實舒芬太尼能夠減輕心肌損傷，保護心肌組織。

而關于舒芬太尼的具體作用機制，本研究主要從細胞自噬方面分析。LC3Ⅱ和Beclin-1均為細胞自噬相關蛋白。LC3Ⅱ屬于自噬體膜蛋白，為自噬體的標志分子，其水平與自噬泡的形成數量有關，可以相對定量評價自噬的活性程度；Beclin-1為酵母自噬相關基因6的同源物，屬于自噬激活的參與蛋白，可調控自噬體形成過程。Disatnik等[15]通過體外研究發現，缺血再灌注損傷期間的自噬活性升高與Beclin-1過度表達有關。本研究結果顯示，與模型組比較，3-MA組和舒芬太尼組大鼠心肌組織LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達水平降低，且舒芬太尼組大鼠心肌組織LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達水平低于3-MA組，表明舒芬太尼可以有效下調LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白表達，抑制自噬過度激活，減輕相關損傷。

細胞自噬除了引起細胞代謝障礙外，激活超過一定閾值還會引發Ⅱ型程序性細胞死亡或凋亡，而這個過程取決于Beclin-1和Bcl-2之間的平衡。Bcl-2是常見的凋亡分子，具有抑制細胞凋亡的作用，Maejima等[16]研究認為，Bcl-2對于Beclin-1有負性調節作用，剝奪心肌細胞營養后，Bcl-2表達下降，能夠促進Beclin-1激活介導細胞凋亡和自噬。Bax屬于Bcl-2家族的促凋亡蛋白，具有加速細胞凋亡的作用，故相關研究中多采用Bcl-2/Bax比值來評價細胞凋亡的程度。本研究結果顯示，與模型組比較，3-MA組和舒芬太尼組大鼠心肌組織Bax蛋白表達水平降低，Bcl-2蛋白表達水平及Bcl-2/Bax比值升高，且舒芬太尼組大鼠心肌組織Bax蛋白表達水平低于3-MA組，Bcl-2蛋白表達水平及Bcl-2/Bax比值高于3-MA組，表明舒芬太尼能夠調控Bcl-2、Bax蛋白表達，抑制心肌細胞凋亡，從而使得舒芬太尼組大鼠心肌組織AI低于3-MA組，缺血再灌注損傷的程度相應減輕。

綜上所述，舒芬太尼能明顯減輕心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷，減少心肌細胞凋亡，其作用可能與下調LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達，抑制心肌細胞自噬有關。