SIRT1信號通路在白藜蘆醇保護腦缺血再灌注損傷中的作用機制

周 游金勝昔何 婷

腦血管疾病因其致殘率、死亡率極高，給家庭和社會造成巨大的經濟和精神負擔，其中缺血性腦血管疾病占全部腦血管疾病的 60%～80%，是目前重點防治的一類疾病。腦組織缺血后再灌注過程是腦缺血性疾病常見的病理變化，其中以缺血/再灌注后神經元凋亡所引起的繼發性腦損傷危害最大，常導致嚴重的神經功能障礙[1-2]。因此，尋找有效的防治腦缺血/再灌注損傷及減輕神經功能損害的新措施并在臨床上推廣應用，是腦缺血疾病研究中亟待解決的關鍵問題，而同時探索臨床行之有效的神經保護劑顯得極其重要。

沉默信息調控因子1(sirtuins 1，SIRT1)是廣泛存在于哺乳動物中NAD+依賴的去乙酰化酶，因被報道在哺乳動物腦神經元中高表達，可促進神經的損傷修復而受到廣泛關注[3-4]。有文獻報道，SIRT1活化后可通過抑制氧化應激，減輕細胞凋亡發揮抗缺血再灌注損傷[5-6]，但目前大多數研究集中在SIRT1通過抑制心肌細胞凋亡發揮抗心肌缺血/再灌注損傷的作用方面，對腦缺血/再灌注損傷后神經元凋亡的作用尚不明了。

白藜蘆醇(Resveratral，Res)是一種天然的多酚類化合物，具有廣泛的生物學和藥理學活性，研究發現，白藜蘆醇較易透過血-腦屏障進入腦組織，對包含腦缺血在內的多種神經疾病實驗模型具有保護作用[7-8]。其腦缺血保護作用可能與抗氧化應激[9]、抑制細胞凋亡[10]、減輕血-腦屏障功能失調、調節基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)/TIMP平衡[11]等有關，但其確切的機制眾說紛紜。白藜蘆醇被認為是目前為止最強的SIRT1激動劑，但白藜蘆醇是否可通過激活SIRT1而抑制神經元凋亡，從而發揮腦缺血保護作用，有待進一步研究。因此，本研究旨在探討白藜蘆醇對大腦缺血再灌注損傷后大鼠神經元凋亡的影響及其作用機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑 TRIzol購自Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒購自谷歌生物技術有限公司，聚合酶鏈式反應(PCR)引物購自上海英俊生物技術有限公司，白藜蘆醇購自Sigma公司，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC)購自Sigma公司。

1.2 動物模型制備及分組 健康雄性SD大鼠購自湖北省實驗動物中心(No：42000600013145)，體重(200±20)g。依據文獻報道采用血管內線栓阻斷法制備大鼠大腦中動脈栓塞缺血再灌注模型(MCAO)[12]。具體步驟如下：10%水合氯醛腹腔注射麻醉，頸部右旁正中切口，鈍性分離暴露右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈。結扎頸外動脈和頸內動脈分支血管，將頸外動脈近頭端、近心端結扎，以動脈夾臨時阻斷頸總動脈和頸內動脈，頸總動脈分叉處切口，松開動脈夾向頸內動脈插入尼龍線17～20 mm，如能感覺到阻力，結扎頸總動脈并固定尼龍線，外留長約1 cm線頭，縫合傷口。栓塞缺血2 h后，將線栓拉出使之再灌注，縫合手術切口，術后維持大鼠體溫25～30 ℃，蘇醒后自由飲食。實驗大鼠隨機分為假手術組(Sham組)、腦缺血再灌注模型組(MCAO組)、白藜蘆醇低劑量組(Res 10組)、白藜蘆醇高劑量組(Res 30組)，每組15只。Sham組僅分離頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，不插入線栓及缺血處理；MCAO組栓塞2 h后，再灌注24 h；Res 10組術前1 h給予白藜蘆醇10 mg/kg預處理；Res 30組術前1 h給予白藜蘆醇30 mg/kg預處理。

1.3 神經功能損傷評估 大鼠腦缺血再灌注24 h后對大鼠進行神經功能損傷評估(Longa評分)[8，12]，具體評分標準如下：0分，正常，大鼠的活動能力未發生明顯變化；1分，大鼠不能完全伸展缺血對側前肢；2分，大鼠缺血對側肢體癱瘓，行走時轉圈，出現追尾現象；3分，大鼠行走搖擺不定，行走困難，向癱瘓側跌倒；4分，大鼠出現意識障礙，無自發性活動。其中，評分1～3分認為動物模型制作成功，0分和4分均剔除并隨機補全。

1.4 TTC法檢測腦梗死體積 大鼠行神經功能損傷評估后即處死并取出腦組織，-20 ℃冷凍20 min，去除小腦、嗅球等，沿冠狀面進行切片(2 mm厚)，將切片置于2% TTC磷酸鹽緩沖液中，37 ℃染色30 min后(避光)，白色為梗死區域，鮮紅色為正常腦組織，顯色后的腦切片置于4%多聚甲醛中固定。小心分離白色和紅色組織，分別稱重，計算腦梗死體積：腦梗死體積(%)= 白色區重量/(白色區重量+非白色區重量)×100%。

1.5 TUNEL法檢測細胞凋亡 取大鼠缺血區腦組織置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋切片，按TUNEL 檢測試劑盒說明書進行操作，檢測缺血區神經元細胞凋亡。TUNEL染色后，陽性細胞(+)發出綠色熒光，在40倍光鏡下量化TUNEL(+)細胞，選取5個視野，測定TUNEL(+)細胞平均百分比。

1.6 腦組織含水量檢測 采用干濕重法測定大鼠腦組織含量，實驗結束后取缺血側腦組織稱濕重，然后放入110 ℃烤箱烘干，再稱取腦組織干重。腦組織含水量(%) = (濕重-干重)/ 濕重×100 %。

1.7 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR) 取適量大鼠腦組織，提取總RNA，逆轉錄為cDNA然后純化，檢索目標基因的序列，設計并合成引物(見表1)；從擴增曲線上確定CT值，以GAPDH為內參，構建CT值拷貝數定量標準曲線，根據各自檢測CT值得出樣本中SIRT1、Bax和Caspase-3的相對表達水平變化。

表1 RT-PCR引物序列

2 結 果

2.1 白藜蘆醇對大鼠腦組織缺血再灌注神經損傷的影響 Sham組大鼠神經功能損傷評分為0分，未見明顯神經功能損傷癥狀；與Sham組比較，MCAO組大鼠再灌注24 h后神經功能損傷評分呈明顯升高趨勢(P<0.01)；與MCAO組比較，Res 30組大鼠神經功能損傷評分明顯降低(P<0.01)。詳見圖1。

Sham組大鼠未見有白色梗死組織，MCAO組可見明顯白色梗死組織，從皮層延伸到皮質下白質，與Sham組比較差異有統計學意義(P<0.01)，不同濃度白藜蘆醇可使大鼠的梗死體積明顯縮小，同時白藜蘆醇劑量越大，大鼠腦梗死體積越小，Res 10組、Res 30組與MCAO組比較差異均有統計學意義(P<0.01)。詳見圖2。

與Sham組比較，MCAO組腦水腫明顯(P<0.01)；與MCAO組比較，Res 30組腦組織含水量明顯減少，腦水腫明顯減輕(P<0.01)。詳見圖3。

注：與Sham組比較，*P<0.01；與MCAO組比較，△P<0.01。

注：與Sham組比較，*P<0.01；與MCAO組比較，△P<0.01。

注：與Sham組比較，*P<0.01；與MCAO組比較，△P<0.01。

圖3各組腦組織含水量比較

2.2 白藜蘆醇對大鼠腦缺血再灌注損傷神經元凋亡的影響 TUNEL染色結果顯示，MCAO組大鼠TUNEL(+)細胞數較Sham組明顯增加(P<0.01)，RT-PCR檢測發現，MCAO組Bax和Caspase-3 mRNA表達明顯高于Sham組(P<0.01)；不同劑量白藜蘆醇干預均可抑制神經元凋亡，以高劑量抑制作用更明顯，Res 10組、Res 30組與MCAO組比較差異均有統計學意義(P<0.01)。詳見圖4～圖6。

注：與Sham組比較，*P<0.01；與MCAO組比較，△P<0.01。

圖4各組TUNEL(+)細胞數比較

注：與Sham組比較，*P<0.01；與MCAO組比較，△P<0.05，#P<0.01。

圖5各組BaxmRNA表達比較

注：與Sham組比較，*P<0.01；與MCAO組比較，△P<0.01。

圖6各組Caspase-3mRNA表達比較

2.3 白藜蘆醇對腦組織SIRT1表達的影響 MCAO模型組大鼠腦組織中SIRT1 mRNA水平明顯低于Sham組(P<0.01)，Res 10組、Res 30組SIRT1表達水平較MCAO組明顯增加(P<0.01)，以Res 30組增加更為明顯。詳見圖7。

注：與Sham組比較，*P<0.01；與MCAO組比較，△P<0.01。

圖7各組SIRT1mRNA表達比較

2.4 SIRT1與腦缺血再灌注神經功能損傷的相關性 Pearson相關性分析顯示，SIRT1 mRNA表達與腦梗死體積、腦組織含水量均呈負相關(r=-0.673 5，P<0.01；r=-0.518 5，P<0.01)，提示腦組織中SIRT1 mRNA 表達與腦缺血再灌注損傷嚴重程度呈負相關。詳見圖8、圖9。

圖8 SIRT1 mRNA表達與腦梗死體積的相關性分析

圖9 SIRT1 mRNA表達與腦組織含水量的相關性分析

2.5 SIRT1與腦缺血再灌注損傷神經元凋亡指標相關性 Pearson相關性分析顯示，SIRT1 mRNA表達與TUNEL(+)細胞數、Bax mRNA、Caspase-3 mRNA均呈負相關(r=-0.465 1，P<0.01，r=-0.641 2；P<0.01；r=-0.636 7，P<0.01)，提示腦組織中SIRT1 mRNA表達與腦缺血再灌注后神經元凋亡的嚴重程度呈負相關。詳見圖10～圖12。

圖10 SIRT1 mRNA表達與TUNEL(+)細胞數的相關性分析

圖11 SIRT1 mRNA表達與Bax mRNA的相關性分析

圖12 SIRT1 mRNA表達與Caspase-3 mRNA的相關性分析

3 討 論

腦缺血性疾病是神經系統常見病癥，主要病理特點是突發的腦動脈血流供應中斷，造成腦局部組織血液循環障礙，常導致不同程度的神經功能障礙，嚴重威脅人類的健康和生命，給家庭和社會造成沉重的負擔。早期的血管再通并及時恢復缺血區的血液供應是腦缺血性疾病最有效的治療方法，但是再度恢復血流灌注后，隨之而來的是大量氧自由基、炎癥因子的生成，神經細胞的水腫、凋亡及壞死，神經組織的損傷程度反而進一步加重[13]。目前，越來越多的國內外學者對其發生機制、發展和預后進行了深入的研究，認為腦缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中過程中最重要的病理過程之一[14]。因此，抑制或減輕缺血再灌注損傷已成為治療缺血性腦血管疾病中急需解決的關鍵問題。

Res是一種具有多種生物學效應的多酚類化合物，廣泛存在于多種植物中。近年來，Res在腦缺血性疾病中的神經保護作用已成為神經科學領域的研究熱點[15]。臨床上，缺血性腦卒中多為局灶性，其中以大腦中動脈閉塞多見，本研究采用大腦中動脈栓塞模型，觀察Res對腦缺血再灌注損傷后各指標的影響，并進一步探討其保護機制。缺血2 h、再灌注24 h后，大鼠神經功能損傷評分、腦梗死體積以及腦組織含水量均明顯增加，給予Res干預后，可明顯改善缺血再灌注腦組織神經功能損傷。但由于Res的多效性，其在缺血再灌注腦損傷中的神經保護作用及具體機制尚不明確。

腦缺血再灌注后腦組織損傷發生的病理機制十分復雜，可能與興奮性氨基酸神經毒性損傷、氧自由基生成過多、大量促炎因子釋放、線粒體功能損傷以及細胞內鈣超載等相關，這些因素相互影響、相互關聯，最終導致神經元細胞凋亡和壞死。目前亦有研究證實腦組織短時缺血后即可出現神經細胞凋亡，再灌注后加劇，腦組織缺血后再灌注導致神經元凋亡所引起的繼發性腦損傷常引起嚴重的神經功能障礙[16]。抑制凋亡的發生可以減輕再灌注后腦組織的不可逆損傷，因此，尋找有效的抑制神經元細胞凋亡的新措施將成為治療缺血性腦血管疾病的關鍵。本實驗研究結果顯示，與Sham組比較，MCAO組TUNEL(+)細胞數量明顯增多，Bax mRNA、Caspase-3 mRNA表達明顯增加，給予白藜蘆醇干預后可明顯改善神經元凋亡，提示白藜蘆醇可能是通過抑制神經元凋亡而發揮腦缺血再灌注損傷保護作用。

SIRT1是一種NAD+依賴的去乙酰化酶，廣泛表達于各種組織和器官中，與能量代謝、延長壽命、腫瘤、神經退行性等疾病的發生密切相關，同時SIRT1 被報道在哺乳動物腦神經元中高表達。目前，亦有越來越多的證據顯示，SIRT1在腦缺血再灌注損傷中扮演著重要的角色[17]。白藜蘆醇被認為是目前為止最強的SIRT1激動劑，但白藜蘆醇對缺血再灌注損傷后抑制神經元凋亡及神經保護作用是否與SIRT1 的激活有關，目前尚未見報道。因此，有必要進一步研究SIRT1信號通路在腦缺血/再灌注損傷中對神經元凋亡的影響及其分子機制。本研究采用RT-PCR方法檢測缺血側腦組織中SIRT1的mRNA表達，結果顯示，假手術組大鼠腦組織中SIRT1 mRNA表達量最多，在腦缺血再灌注24 h后，缺血側腦組織中SIRT1 mRNA表達明顯下降，相關性檢測研究分析顯示，SIRT1 mRNA表達與腦梗死體積及腦組織含水量均呈負相關，說明SIRT1可能參與腦缺血再灌注損傷的發生過程。另一方面，目前大多數SIRT1研究集中于其通過抑制心肌細胞凋亡發揮抗心肌缺血/再灌注損傷的作用方面，對腦缺血/再灌注損傷后神經元凋亡的作用尚不明了。本研究結果顯示，SIRT1 mRNA表達與Bax mRNA、Caspase-3 mRNA 表達呈負相關。

總之，白藜蘆醇可以抑制大腦中動脈栓塞誘導的腦缺血再灌注神經功能損傷，并抑制腦神經元凋亡。本實驗進一步研究發現，白藜蘆醇可通過上調SIRT1表達從而下調Bax、Caspase-3 mRNA的表達，這可能是其發揮抗腦缺血再灌注損傷的重要機制，但其確切機制還需要進一步研究。