冠狀動脈支架內再狹窄與血液中GDF15、PDGF的關系探討

生長分化因子15(growth differentiation factor 15，GDF15)為轉化生長因子β家族成員之一，正常狀態(tài)下機體內的表達具有明顯的組織特異性，主要表達于胎盤組織，少量表達于胰、腎、結腸、前列腺等組織[1]。但病理狀態(tài)下，如手術應激、組織創(chuàng)傷以及炎癥干擾等，刺激GDF15表達明顯上調，諸多研究證據(jù)也表明GDF15與炎癥反應、細胞凋亡、血管再生密切相關[2]。血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)儲存在血小板α顆粒內，為低分子量促細胞分裂素，血小板崩解時被釋放、激活，能誘導中性粒細胞及巨噬細胞的趨化，還能誘導血管收縮、細胞分裂、卵磷脂酶的激活等[3]。冠狀動脈支架植入術是目前治療冠心病較安全有效的方法，主要不良事件為冠狀動脈支架內再狹窄[4]。近年來多項研究表明，血液中GDF15及PDGF與冠心病有關[5]。本研究主要探討冠狀動脈支架術后病人血液中GDF15及PDGF水平與支架內再狹窄事件發(fā)生的關系。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年8月—2017年8月于濮陽市安陽地區(qū)醫(yī)院經(jīng)冠狀動脈造影術(CAG)確診并實施動脈支架植入術的冠心病病人120例，其中男86例，女34例；年齡52～82(66.8±10.1)歲。術后12個月復查CAG，將發(fā)生冠狀動脈支架內再狹窄病人納入觀察組，共50例，未發(fā)生冠狀動脈支架內再狹窄病人納入對照組，共70例。兩組病人年齡、性別、基礎用藥等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，所有病人均簽署知情同意書。

1.2 檢測指標及方法

1.2.1 樣本收集 術后12個月采集病人空腹靜脈血6 mL(兩管)，分離并檢測其中一管血單個核細胞內GDF15 mRNA和PDGF mRNA，另外一管血在離心機內以4 000 r/min離心3 min，留取上層血清至EP管內，檢測血清中GDF15及PDGF的蛋白水平。

1.2.2 RT-PCR技術檢測血清中單個核GDF15 mRNA和PDGF mRNA的含量 Trizol法提取單個核細胞中總mRNA，GAPDH mRNA的表達水平為內參。GDF15上游引物：5′-GTTAGCCAAAGACTGCCACTG-3′，下游引物：5′-CCTTGAGCCCATTCCACA-3′；PDGF上游引物：5′-TACTCCTCTTAAGCTGCGTATTCGG-3′，下游引物：5′-GCGTGGTTACGGTTGAACGACCACA-3′；GAPDH上游引物：5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3′，下游引物：5′-GGAAGATGGTGATGGGATTT-3′。

1.2.3 血清中GDF15及PDGF蛋白水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清中GDF15及PDGF的蛋白水平，人GDF15及PDGF試劑盒均購于美國SIGMA公司。所有步驟嚴格遵循試劑盒說明書操作。

2 結 果

2.1 兩組單個核細胞內GDF15 mRNA和PDGF mRNA水平比較 RT-PCR的結果顯示，觀察組血液中單個核細胞GDF15 mRNA和PDGF mRNA的水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組單個核細胞內GDF15 mRNA和PDGF mRNA水平比較(±s)

2.2 兩組血清中GDF15與PDGF的蛋白水平比較 觀察組血清中GDF15與PDGF蛋白水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 兩組血清中GDF15和PDGF的蛋白水平比較(±s) 單位：pg/mL

2.3 再狹窄病人GDF15和PDGF的相關性 將再狹窄病人血液單個核細胞內GDF15 mRNA與PDGF mRNA、血清中GDF15蛋白與PDGF蛋白進行Pearson相關分析，結果顯示：再狹窄病人血液單個核細胞內GDF15 mRNA與PDGF mRNA呈正相關(r=0.646，P<0.05)；血清中GDF15蛋白與PDGF蛋白也呈正相關(r=0.421，P<0.05)。詳見圖1、圖2。

圖1 再狹窄病人GDF15 mRNA和PDGF mRNA的相關性

圖2 再狹窄病人GDF15蛋白和PDGF蛋白的相關性

3 討 論

冠狀動脈支架植入術能直接開通狹窄的冠狀動脈，有效緩解心肌缺血，但術后支架內再狹窄事件的發(fā)生一直困擾臨床[6]。術后支架內再狹窄事件發(fā)生的可能機制：炎癥因子的合成、釋放、聚集、浸潤以及血管壁的破壞引起某些因子的增加[7]。因此，本研究探討冠狀動脈支架術后病人血液中GDF15及PDGF在支架內再狹窄事件中的臨床應用價值。

生理狀態(tài)下，GDF15別名為胎盤轉化生長因子β、非甾體抗炎活化基因1，蛋白編碼基因位于19號染色體的短臂13.2～13.1。GDF15由308個氨基酸殘基經(jīng)剪切、折疊、聚合等修飾成為25 kDa的蛋白質，主要表達于胚胎組織，心臟中并不表達[8]。但病理條件下，如心肌缺血再灌注、缺氧、心力衰竭等損傷發(fā)生時，內源性一氧化氮合成酶2(eNOS2)、早期生長反應因子-1(Egr-1)、P53等誘導GDF15表達[9]。研究發(fā)現(xiàn)，股動脈被結扎的小鼠模型中，GDF15的表達水平升高，促進破骨細胞分化，在缺血性腦卒中也發(fā)現(xiàn)GDF15的表達量明顯增高[10]。目前研究表明，GDF15為新發(fā)現(xiàn)的心血管疾病危險因子，對急性胸痛病人危險分層發(fā)現(xiàn)GDF15水平與急性胸痛發(fā)生率及死亡率相關[11]。此外，GDF15水平與冠狀動脈狹窄有關，并與其嚴重程度具有相關性，可提示側支循環(huán)缺陷及病變冠狀動脈數(shù)。但關于GDF15在冠狀動脈支架術后與再狹窄的變化未見報道。此次研究選取120例冠狀動脈支架植入術的病人，觀察12個月后GDF15的mRNA及蛋白表達變化情況。結果顯示：與未發(fā)生術后再狹窄事件的病人相比，發(fā)生術后再狹窄病人GDF15 的mRNA及蛋白水平均明顯升高，表明GDF15水平的增高與冠狀動脈支架內再狹窄的發(fā)生有關。PDGF為一種堿性蛋白質，受刺激部位的巨噬細胞、血小板、內皮細胞等均能分泌PDGF，分子量約30 kDa。與膜上受體結合后PDGF的主要生物學作用包括[12]：①創(chuàng)傷早期誘導周圍的巨噬細胞、中性粒細胞、成纖維細胞等聚集，激活免疫反應；②促進毛細血管收縮，誘導內皮細胞的分裂增殖，促進血管再生；③刺激成纖維細胞等的分裂；④參與卵磷脂的循環(huán)及前列環(huán)素的代謝，加速骨吸收。本研究結果顯示：與未發(fā)生術后再狹窄事件的病人相比，發(fā)生術后再狹窄病人PDGF的mRNA及蛋白水平均明顯升高，表明PDGF水平的增高與冠狀動脈支架內再狹窄的發(fā)生有關。究其原因，冠狀動脈支架植入術時改變病人原有的血管壁結構，療效肯定，但不可避免會造成內膜損傷、斑塊破裂等，從而激活外源性、內源性的凝血系統(tǒng)，激活并釋放多種活性物質。在此過程中，單個核細胞內PDGF的表達會明顯增高。當合并某些慢性疾病如高血糖或支架貼壁不完全，均會導致術后再狹窄事件的發(fā)生[13]。本研究還發(fā)現(xiàn)，血液中GDF15 mRNA與PDGF mRNA、GDF15蛋白與PDGF蛋白具有一定的正相關，提示冠狀動脈支架內再狹窄事件發(fā)生時，GDF15與PDGF具有某種調控關系，但具體的機制還有待進一步研究。

冠心病治療過程中冠狀動脈支架植入術后對病人的隨訪十分重要。目前隨訪的主要手段包括冠狀動脈造影、CT血管成像(CTA)等，但缺少有效、經(jīng)濟的臨床隨訪生物學指標[14]。通過上述回顧性研究表明，血液中GDF15 mRNA、GDF15蛋白、PDGF mRNA及PDGF蛋白與冠狀動脈支架術后病人發(fā)生再狹窄事件有關，但它們作為新的冠狀動脈支架內再狹窄的標志物還需要更多的臨床研究加以證實。