免疫球蛋白基因重排在濾泡性淋巴瘤中的應用

許 潔，崔 倩，張科平，陳 潔，林丹義，徐方平，朱小蘭，駱新蘭

濾泡性淋巴瘤(follicular lymphoma, FL)起源于濾泡生發中心B細胞一類非霍奇金淋巴瘤，由于其癥狀不明顯，就診時，多數已為Ⅱ～Ⅲ期，因此早期診斷十分重要[1]。FL與淋巴濾泡反應性增生的鑒別診斷，絕大多數病例依據組織學特征并結合臨床表現便可以做出明確診斷，也有不少疑難病例借助免疫組化、分子遺傳等技術進行鑒別和確診，基因重排分析確定B細胞增生的克隆性，有助于解決這一問題[2]。本文應用PCR-GeneScan法檢測39例FL免疫球蛋白重鏈/輕鏈(IgH/L)基因重排，統計分析克隆性IgH/L基因重排與腫瘤分級的關系，探討其對于濾泡性淋巴瘤早期診斷的作用。

1 材料與方法

1.1 標本收集2016年9月～2019年2月廣東省人民醫院病理科診斷的39例FL石蠟標本，均為手術標本，平均年齡(54.64±17.47)歲，根據WHO(2008)淋巴造血系統腫瘤分級標準[3]，其中15例為FL1，7例為FL2，17例為FL3(11例為FL3A，6例為FL3B)。

1.2 主要儀器與試劑基因重排檢測試劑盒(IgH3+IgK,PCR毛細管電泳法，CL220001),基因重排檢測試劑盒(HE，PCR毛細管電泳法，CL220004)，基因重排檢測試劑盒(IgL，PCR毛細管電泳法，CL220006)由上海源奇生物公司提供，引物序列均來源于BIOMEN-2的研究成果[4]；QIAamp石蠟標本DNA提取試劑盒(56404)購于德國Qiagen公司；去離子甲酰胺HIDI(ABI公司)；分子內標GS500Liz(ABI公司)；POP7膠(ABI公司)；基因擴增PCR儀(美國ABI Veriti)；基因測序儀(美國ABI3500DX)；Nanodrop 2000超微量分光光度計(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 基因組DNA提取切取10 μm厚組織4片，切片貼于干凈的玻片上。二甲苯脫蠟至水后，按照HE染色片所選取的腫瘤區域小心用無菌刀片將腫瘤組織刮入1.5 mL的EP管中。應用QIAamp石蠟組織DNA抽提試劑盒提取DNA。DNA利用Nanodrop 2000超微量分光光度計檢測其濃度及吸光度(A)值，經0.8%瓊脂糖電泳判定其質量。

1.4 PCR+基因掃描法(1)PCR反應體系采用基因重排檢測試劑盒(上海源奇生物公司)包括：模板DNA至少100 ng；PCR預混反應液包括IgH管A、B、C，IgK管A、B，IgL，對照基因管(引物序列參照BIOMED-2研究結果[4])；Ampli Taq Gold DNA聚合酶。各反應體系配制：PCR反應液16 μL+ Ampli Taq Gold DNA聚合酶1 μL+DNA(包括待檢樣本，相應的陽性對照、空白對照)3 μL。反應條件：95 ℃ 7 min，95 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 90 s,合計40個循環，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。(2)基因掃描試劑配制：PCR擴增產物1 μL+LIZ500 0.5 μL+HIDI 10 μL，變性條件：95 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min，將上述變性產物在基因測序儀上進行毛細管電泳。(3)結果判讀：對照基因管若在100、200、300、395 bp收集到ROX熒光信號，表示DNA的質量符合實驗要求，相應的陽性對照在有效的范圍內收集到不連續的熒光信號，而空白對照未收集除引物峰以外的熒光信號，如實驗滿足以上有效條件，在有效范圍內的1個或2個強陽性條帶的樣本提示基因重排為陽性，反之為陰性。

1.5 統計學分析所有數據應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，采用χ2檢驗和Spearman等級相關檢驗。

2 結果

39例FL中有29例(29/39，74.36%)IgH/L基因重排陽性，其中，FL1基因重排的檢出比例為8/15，FL2重排的檢出比例為5/7，FL3重排的檢出比例為16/17，僅1例FL3B未檢出克隆性重排。Spearman等級相關檢驗和χ2檢驗結果顯示，IgH/L基因重排在FL3中的檢測率高于FL1、FL2，其檢出率與FL的分級呈顯著正相關(rp=0.376,P<0.001)，FL1、FL2和FL3中表達差異有顯著性(P=0.004)，FL3A(11/11)與FL3B(5/6)檢出率差異無統計學意義(P=0.209)；15例IgH基因重排陽性(15/39，38.46%)，聯合IgK，檢出率提升至74.36%(29/39)，差異有統計學意義(P=0.003)。

3 討論

FL是最常見的惰性淋巴瘤，根據WHO(2008)淋巴造血系統腫瘤分級標準，FL可分為3級，其中FL1和FL2屬于低級別淋巴瘤，FL3屬于高級別淋巴瘤，FL3可進一步分為3A和3B[3]。FL3尤其是FL3B常伴彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma)區域[5]。非霍奇金淋巴瘤是一種原發于淋巴結及其他淋巴組織的惡性腫瘤，克隆性重排是克隆性增生和譜系來源的標志，已被公認為淋巴瘤診斷、鑒別診斷和治療后監測的重要指標[6]；本組39例FL中，29例(29/39，74.36%)IgH/L基因重排陽性，檢出率與國內報道相近[7-9]，其中FL1基因重排的檢出比例為8/15，FL2重排的檢出比例為5/7，而FL3重排的檢出比例為16/17，僅1例FL3B未檢出克隆性重排，FL1、FL2和FL3中克隆性重排的檢出率差異有統計學意義(P<0.05)，FL3A與FL3B檢出率差異無統計學意義(P>0.05)；本實驗結果顯示，IgH/L基因重排在FL3中的檢測率高于FL1、FL2，其檢出比例與FL的分級呈正相關。80%～90%的FL中發現t(14;15)(q32;q21)染色體易位，其在FL形成和形成早期是一個關鍵性的分子改變，在FL1～2級中約占85%，而FL3級尤其是FL3B級中t(14;15)易位少見，僅占15%～30%，形成這種差異可能與FL3B級中無殘留的濾泡中心細胞有關[10]。本組實驗結果顯示，PCR-GeneScan檢測IgH/L基因重排在FL3的檢出率高，有效地彌補了單純FISH法檢測t(14;15)(q32;q21)染色體易位的缺陷。對于FL，由于發生體細胞超突變，導致VH基因片段的缺失，使IgH基因擴增出現假陰性而檢出率降低，IgK重排很少受體細胞超突變的影響，因此聯合IgK重排的檢測可大大提高診斷的檢出率[11-12]，本組39例FL中，15例(15/39，38.46%)IgH基因重排陽性，聯合IgK檢出率提升至74.36%(29/39)，差異有統計學意義(P<0.05)。IgH、IgL基因重排被認為可作為B細胞非霍奇金淋巴瘤的輔助診斷方法，近年開展的PCR法基因重排檢測技術，克服了傳統技術存在操作繁雜、耗時長等缺點，廣泛被應用；分析技術目前臨床上主要為凝膠電泳異源雙鏈分析和基因掃描分析。基因掃描可以產生清晰的峰圖，可以探測到0.5%～1.0%的克隆性淋巴細胞，即使有一個堿基的差別，基因掃描后通過圖像峰的位置、高度、大小展示，是一種十分靈敏和精確的檢驗手段，有著廣泛的應用空間[13]。本實驗使用PCR-GeneScan檢測IgH/L基因重排，利用Ig基因重排檢測對濾泡性淋巴瘤的診斷有輔助性作用，并且利用PCR-GeneScan法可提高重排檢測的敏感性和特異性，對于濾泡性淋巴瘤的早期診斷有一定的價值，值得推廣。