急性呼吸窘迫綜合征的新希望-間充質干細胞

范新元 崔恩海

一、ARDS與MSCs概述

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是指急性肺損傷進展為急性呼吸衰竭的一個動態演變過程，可由多種致病因素引起，如肺炎、敗血癥、急性胰腺炎及重大創傷等，主要病理特征為急性彌漫性肺實質炎癥及血管通透性增加，是危重疾病和累及生命的肺部疾病的常見并發癥。針對ARDS，目前沒有統一的且能被廣泛應用的特效藥物[1]，臨床治療以機械通氣、液體管理、病因治療及營養對癥支持為主。據國外臨床數據統計分析[2]，ARDS患病率占重癥監護病房入住率的10%，而其死亡率在35%至46%。因此，迫切需要新的治療方法逆轉ARDS的疾病進程、改善ARDS患者的生存質量及降低死亡率。

干細胞(stem cells)是指原始且未充分分化的潛在功能細胞，可再生為各種組織器官，按照哺乳動物發育過程的先后，可分為胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)及成體干細胞(adult stem cells)。間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs) 又稱為多能間充質基質細胞，是一種可以自我復制的非終末分化成體干細胞。近年來，MSCs在治療炎癥性腸病[3]、系統性紅斑狼瘡[4]等組織損傷性疾病中起重要作用，通過發揮免疫調節潛力，調控炎癥等級作用，減緩疾病的進展，有動物試驗模型及臨床前期研究結果證實MSCs對ARDS的有效性，為ARDS的臨床治療提供了一個新希望。

二、MSCs的應用背景

MSCs的生物學特性有利于其在臨床上的廣泛應用。上世紀60年代末，Friedenstein從骨髓中提取到一種外形呈類纖維細胞的長梭形基質細胞，培養時易貼壁生長，且可于體外大量培養擴增，并命名為MSCs，后續研究發現其在炎癥性腸病、系統性紅斑狼瘡等疾病治療中展現了良好的應用前景。MSCs的良好應用前景取決于它的一系列特性：1)易提取：MSCs作為一種由胚胎早期中胚層細胞發育而來的成體干細胞，可存在于全身多個組織和器官中，如骨髓、臍帶、胎盤、脂肪等；2)低免疫原性[5]：由于II型主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex II, MHC-II)及T細胞協同刺激分子(CD40、CD80、CD86等)不表達于MSCs表面，導致T細胞活化通路中的第二信號喪失，使得同種異體MSCs的移植手術無需配型；3)低致瘤作用[6]：MSCs從宿主組織中提取后即可在體外迅速增殖，但移植后在體內壽命短，因此致瘤作用比較低。4)易擴增培養：MSCs有能力分化為各種細胞，且易于擴增培養。研究發現[7-8]在無血清培養體系中應用組織塊法分離培養MSCs可以有效降低成本，簡化操作，提高細胞遷出率及消除有未確定的病原體引起的風險。由于MSCs缺乏特異性的細胞表面標志物，國際細胞治療協會(ISCT)在2006年為定義MSCs制定了最低鑒定標準[9]：MSCs在組織培養基上應該緊密貼壁生長；在適當的體外條件下，MSCs有能力分化為各種細胞，如骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞等；MSCs細胞表面陽性表達CD73、CD90及CD105，陰性表達CD14/11b、CD34、CD45、CD79a/CD19及HLA-DR。

三、MSCs參與ARDS的可能機制

1.MSCs通過直接分化機制參與ARDS。在ARDS的疾病進程中，病理改變的關鍵是肺泡-毛細血管屏障受損，基于MSCs的多向分化潛能特點，最初研究時人們傾向于MSCs對ARDS的有效性在于MSCs可特異性歸巢至肺損傷部位，直接分化為肺泡上皮細胞及血管內皮細胞，通過修復損傷肺組織，恢復肺部結構及肺功能。Zhang等研究發現[10]，MSCs通過過度表達p130或E2F4，從而調節細胞周期，尤其是G1相，可以促使MSCs轉化成肺泡II型細胞，并改善ARDS小鼠上皮細胞的功能。而另一項試驗中[11]，使用同等劑量的骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs)移植入煙霧介導的肺損傷裸鼠模型及健康對照組，研究發現肺損傷裸鼠模型中細胞信號雖強于健康對照組，但在7.5 h達到峰值后，隨著時間推移信號逐漸減弱，且在第5 d的時候試驗組的肺部細胞信號完全消失，該研究結果引起了很大爭議，在如此短的時間內BM-MSCs是否能夠分化成肺部受損細胞？不同來源的MSCs在不同致病因素的試驗模型中結果是否與此相同？盡管現在的研究對分化機制產生了疑議，但我們依然不能完全排除分化機制可能。

2.MSCs通過旁分泌機制參與ARDS。ARDS是機體失控的全身樣炎癥反應的肺部體現，在ARDS的病程中，炎癥細胞及其釋放的炎癥介質、細胞因子起關鍵作用[12]。隨著對ARDS的研究認知不斷發展，現在的主流觀點認為MSCs可以直接分泌或促進一系列細胞因子及生長因子的產生，通過組織間隙作用于肺損傷部位，發揮多種生物學功能逆轉ARDS的病理生理過程。(1)MSCs通過提高炎癥部位抗炎因子的濃度，抑制促炎因子的釋放，減輕炎癥反應。有研究發現[13]，在呼吸機誘導成的小鼠肺損傷模型中應用MSCs，可減少肺泡中性粒細胞浸潤，降低支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細胞因子誘導的中性粒細胞趨化因子-1(CINC-1)及白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)水平，減輕肺損傷及恢復肺結構。另一項研究中[14]，在通過大腸桿菌內毒素誘導成小鼠肺損傷模型中，使用MSCs可降低BALF及血漿中促炎因子的含量，如腫瘤壞死因子(TNF-α)及巨噬細胞炎癥蛋白-2(macrophage inflammatory protein-2, MIP-2)，減輕炎癥,同時又提高了抗炎因子IL-10(interleukin-10, IL-10)及IL-13(interleukin-13, IL-13)的釋放，顯著改善了小鼠的生存率，減輕肺損傷程度。(2)MSCs通過調節肺泡上皮-毛細血管內皮屏障的通透性減輕肺水腫，Fang[15]等發現MSCs可旁分泌血管緊張素-1(Ang-1)，能維持肺微血管內皮細胞完整性，降低肺泡Ⅱ型上皮細胞通透性，從而保護氣血屏障。另一項研究中[16]，MSCs在肺組織中可以分泌“足夠的”血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，通過阻止已損傷的血管內皮細胞凋亡，維持氣血屏障完整性，保護屏障。(3)MSCs通過增加肺泡液清除率(alveolar fluid clearance, AFC)減輕肺水腫，即正常肺泡上皮細胞通過Na+-K+-ATP酶、Na+通道及水通道蛋白清除肺泡內水腫液的過程，而各種致病因素可導致AFC降低，形成肺水腫。研究發現[17]，在流感病毒感染誘導的肺損傷模型中，MSCs通過增加角化細胞成長因子(keratinocyte growth factor, KGF)的分泌，阻止Na+-K+-ATP酶的下調及鈉氯轉運蛋白的受損增強肺泡液清除，減輕肺水腫。(4)MSCs通過直接清除肺部病原體治療ARDS，造成ARDS的病因及危險因素很多，而微生物病原體的感染最常見，所以如何減少肺內病原體的數量是治療ARDS的一個重點。有研究報道[18]，體外試驗中予大腸桿菌預處理的MSCs條件培養基可以抑制細菌生長，同時MSCs分泌的抗菌肽LL-37明顯增加，進一步完善體內試驗，在大腸桿菌感染小鼠模型移植入MSCs及LL-37抑制劑處理后，肺內細菌清除能力則下降。最新研究發現[19]，MSCs通過toll樣受體4信號通路表達的β-防御素(β-defensin, BD2)也是介導肺內細菌清除的重要旁分泌因子之一。(5)ARDS的后期病理變現為肺纖維化，研究發現[20]急性肺損傷時，MSCs可能通過改變金屬蛋白酶-8(MMP-8)與組織抑制金屬蛋白酶-1(TIMP-1)之間的平衡，促使巨噬細胞的表型從M1(抗炎和抗菌)轉變到M2(創傷修復和炎癥消退)，通過降低肺內膠原纖維含量，降低肺間質的纖維化程度。

3.MSCs通過釋放微泡及傳遞線粒體參與ARDS。長期以來，對微泡的定義是作為一種物質載體存在于細胞的分泌外排過程中。隨著研究發現[21]，不同組織來源的細胞分泌的微泡除了具有某些共性外，其功能與其來源的母細胞具有直接聯系，MSCs來源的細胞微泡(microvesicles, MVs)主要通過其包含的micro-RNA，各種蛋白和線粒體發揮治療作用。Monsel等[22]在大腸桿菌誘導的小鼠肺損傷模型中，同時移植人BM-MSCs來源的MVs和MSCs，兩組小鼠的生存率及細菌清除能力均顯著增加，肺損傷嚴重程度同樣降低，表明MVs和MSC的治療作用相似，也證實了MSC的部分功效源于攜帶基因物質的微泡。另一研究[23]發現線粒體可以被MSCs轉運至巨噬細胞，能夠增強其吞噬能力。在其他組織器官損傷修復模型中，線粒體傳遞被認為是一種細胞修復機制，這可能是MSCs治療ARDS時抗菌減輕肺損傷的一個新機制。

四、優化MSCs療效

目前已有兩項完成的MSCs治療ARDS患者的Ⅰ期臨床研究[24-25]證實了MSCs治療ARDS的安全性，但ARDS患者的預后并未明顯改善。如何進一步提高MSCs的療效是研究中的一個重點，有以下幾種觀點：1)通過選擇最佳的MSCs的來源來提高MSCs的療效。MSCs具有異質性，因此選擇合適的供體時，需考慮年齡、性別、健康情況等因素。另外Philipp Mattar等發現[26]，同一供體不同來源的MSCs調控不同亞群免疫細胞的能力有些許差異，且不同的體外培養環境導致了MSCs的免疫抑制能力也稍有不同，目前仍缺乏針對ARDS選擇最合適的MSCs來源的研究。2)通過改變MSCs的培養環境增強MSCs的療效。缺氧是ARDS肺損傷部位微環境的典型特征之一，通過影響炎癥因子的含量改變MSCs的免疫調節功能。有研究顯示[27]，低氧環境下培養的MSCs能夠分泌更高水平的VEGF和單核細胞趨化蛋白(MCP-1)，可能是通過激活PI3K-Akt通路，抑制缺氧內皮細胞凋亡，增強免疫調節功能。3)通過選擇最佳的注射方式及劑量增強MSCs的療效，臨床移植MSCs的方式主要有氣道滴注、靜脈及腹腔注射。研究對比發現[28, 13]，治療ARDS時氣道滴注及靜脈給藥較腹腔給藥更能有效的促進動脈氧合的恢復，改善肺順應性，雖然兩項試驗同時證明了MSCs移植治療時劑量與療效是非線性關系，但在MSCs的最佳療效劑量上存在分歧，考慮是否與ARDS的致病因素相關，不同致病因素導致的ARDS在MSCs的最佳療效劑量上可能存在差異，目前并沒有統一研究證實存在最佳移植劑量。4)通過提高肺部MSCs歸巢率提高療效。歸巢即自身或外源性的MSCs定向遷移至肺損傷部位并定植修復的過程，MSCs治療ARDS的成功與否很大程度上依賴于是否有足夠的MSCs歸巢至肺損傷組織，而提高歸巢率主要通過調節相關的趨化因子、黏附分子、生長因子及蛋白酶表達水平來實現。有研究發現，SDF-1-CXCR4軸被認為是關鍵性趨化因子，基質細胞衍生因子-1(SDF-1)是一種小型趨化因子，也稱為CXC趨化因子配體12(CXCL12)，通過與其組織受體CXCR4結合調節MSCs的遷移過程。歸巢過程中涉及的另一重要因素即黏附因子，MSCs通過表達異二聚體蛋白α4/β1整聯蛋白，又稱為晚期抗原4(VLA-4)，與內皮細胞上的VCAM-1結合實現跨內皮遷移[29]。

五、討論

首先是MSCs的最佳來源問題。實驗室制備MSCs組織來源廣泛，但不同來源的MSCs在基因表達和遺傳穩定、分泌蛋白組和細胞表面蛋白存在異質性，這可能影響其免疫調節作用。針對ARDS，MSCs的最佳來源并未形成統一定論，并且實驗室制備MSCs的生產過程需要良好的監管控制，后期儲存目前傾向于冷藏保存溫度，臨床輸注前需檢測細胞活性及無菌性，保證最佳輸注時機，獲得最佳療效，另外需考慮運輸時間長短及運輸方式對細胞活性的影響。

其次是充分的臨床前期研究。眾多的動物模型及臨床前期研究證實了MSCs治療ARDS的可行性，但MSCs治療ARDS作用機制復雜多變。目前發現的直接分化、旁分泌及微泡轉運、線粒體傳遞均有涉及，盡管目前眾多動物模型的側重點在旁分泌機制，但直接分化及微泡、線粒體的研究仍不能停止，繼續深入研究ARDS的發病機制，探索是否有新的修復損傷途徑，通過增強主要作用機制提高MSCs的療效。

MSCs的臨床療效有待驗證。不同致病因素導致了ARDS的輕重程度不一，動物模型中評價MSCs的療效可以通過BALF中炎性因子濃度、細菌計數、濕-干肺比率、MSCs標記物追蹤以及肺組織病理切片等手段，但臨床評估ARDS的嚴重程度時手段相對有限，主要依賴于氧合指數(OI)，即動脈血氧分壓(PaO2)/吸入氧濃度(FiO2)的比值，臨床MSCs治療時可以通過定期監測OI的變化評估療效，也需要同時結合臨床癥狀、肺功能及影像學綜合評估。

綜上所述，ARDS病死率居高不下，但MSCs療法成為治療的一個新希望，通過MSCs治療可逆轉ARDS的疾病進程，改善ARDS患者的生存質量以及降低死亡率。盡管目前在臨床轉化應用前有一系列問題需要解決，但MSCs治療ARDS的前景無需質疑。