IL-6信號通路及其調節GATA-6啟動子甲基化在肺動脈高壓形成中的研究進展

廖劍雄，張一馳，王炳今，張 謙，劉維佳

肺動脈高壓(pulmonary hypertension， PH)是以肺動脈壓力和肺小血管阻力進行性增加為特征的臨床-病理生理綜合征,主要表現為肺血管過度收縮、肺小動脈重構，最終導致心力衰竭。美國流行病學統計資料表明，PH患病率至少為10.6/100萬，年發病率至少為2/100萬[1]。由于治療效果差和疾病不可逆性迅速進展，PH病死率居高不下[2]。若PH不及時控制，患者預期生存時間僅為2.8年[3]。所以研究PH的發病機制，探討其治療新靶點具有重要意義。PH的發生與遺傳、個體、環境等多種因素相關，歐洲心臟病學會/歐洲呼吸病學會于2015年發布最新“肺動脈高壓診斷和治療指南”，將PH分為動脈性PH、左心疾病相關性PH、肺部疾病和(或)缺氧所致PH、慢性血栓栓塞性PH及機制不明和(或)多因素所致PH五大類[4]，但目前研究發現不同類型的PH存在共同的病理基礎，其中肺小動脈重構是主要環節[5-6]。而肺血管內皮細胞損傷和凋亡、肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cell, PASMC)異常增殖、炎性反應等因素共同參與了肺血管重構過程，其中又以炎性反應及PASMC異常增殖為PH肺小動脈重構的中心環節[7]。

近年來在PH動物模型中白細胞介素6(IL-6)信號調控在肺血管重構中的作用已成為PH研究熱點[8]。GATA-6基因主要表達于血管平滑肌,其作用為抑制PASMC進入細胞周期，對維持靜止期PASMC表型的穩定具有重要作用[9]；其通過穩定細胞表型來抑制PASMC異常增殖最終防止肺小動脈重構。因此，闡明GATA-6、IL-6與PH發病的相關性及GATA-6與IL-6的聯系對尋找PH新的治療靶點具有重要意義。

1 IL-6信號通路與PH的關系

1985年Kishimoto等從人T細胞中首先獲得IL-6 cDNA克隆。人體IL-6主要來源于單核細胞和血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMC),通過檢測PH患者肺組織和血清中IL-6的表達水平顯著升高，且單核巨噬細胞產生IL-6越多，動脈重構越迅速[10]。在未經PH造模的正常小鼠中，IL-6的過表達在低氧誘導下導致的肺動脈壓力和肺血管阻力明顯升高[11]，因而認為血清IL-6水平能預測PH患者預后[12-13]。

1.1 IL-6調控TGF-β/Smad信號通路在PH形成中的作用 轉化生長因子(transforming growth factor, TGF)家族主要分為TGF-βs亞家族和骨形態發生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)亞家族，TGF-βs亞家族又分為TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3 3種亞型，其中以TGF-β1活性最強。臨床觀察到PH患者TGF-βs信號亢進及在PH模型中發現編碼BMPs的骨形態發生蛋白受體2(BMPR2)基因突變,均會導致BMP信號減弱[14-15]。TGF-β1是一種抗炎細胞因子，在研究神經干細胞的過程中發現，它具有促進神經發育的作用，腓骨蛋白2(FBLN2)是在這一作用中的重要介質[16]，其通過TGF-β/Smad信號通路維持血管正常結構及調節炎性反應平衡。完整的Smad信號通路包括配體、膜受體、細胞質內信號轉導分子和跨核膜轉運信號分子，該通路中的任意一個表達環節異常均可導致血管重構[17]，但FBLN2主要表達于主動脈中層的動脈平滑肌細胞，是否為PASMC增殖導致PH的主要機制，目前尚不十分清楚。有研究發現，TGF-β1可刺激健康人近端和遠端PASMC的增殖，從而促進自發性PH的形成[18-19]，其機制可能與TGF-β刺激PASMC IL-6生成顯著增加有關，予IL-6抗體后可抑制TGF-β引起的PASMC增殖作用[20]。內皮素1(ET-1)是迄今為止發現的作用最強的縮血管因子,其可間接調控TGF-β1/Smad信號通路而發揮作用。內毒素血癥時肺組織中的ET-1上調，能明顯促進內毒素誘導的PH，其機制可能為ET-1激活G蛋白偶聯的ETA和ETB受體，導致cAMP濃度增加，進而激活磷脂酶C和蛋白激酶C，使得環氧合酶2的表達水平上調，最終促進血管平滑肌收縮及VSMC增殖[21]。但隨后研究表明，ET-1對PASMC的增殖作用需要在炎癥介質的協同下完成，其可能是通過炎癥介質激活MAPK-ERK1/2信號通路來實現的[22]。周細胞又稱Rouget細胞，在肺動脈血管中周細胞參與內皮細胞的生長、增殖、分化等。在慢性缺氧條件下，周細胞可以轉化為收縮型平滑肌細胞而發揮作用，而TGF-β協同IL-6可明顯影響周細胞的這一作用，隨后PH動物實驗證實，TGF-β信號通路被激活后可加速PH的進展[23-24]。

1.2 IL-6通過調控p38MAPK信號傳導導致PH形成 MAPKs是信號傳導過程的重要介質，在各種生理和病理條件下均可被激活，研究發現野百合堿處理使得造模后的大鼠肺部p38MAPK表達明顯上調，而后予選擇性p38MAPK抑制劑則阻止了PH的進展[25]。已有研究表明，IL-6可通過激活p38MAPK細胞內通路刺激胎兒肺發育[26]。Fujita等[27]研究也發現，在MC3T3-E1細胞中凝血酶可通過激活p38MAPK信號通路參與IL-6的合成，該研究在很大程度上證實IL-6與p38信號通路有著直接關系。IL-6表達升高通過對p38信號通路的直接作用來調節PASMC凋亡和增殖，進而促進肺血管重構的發生，這在野百合堿誘導PH大鼠注射胸腺素可抑制肺血管重構的研究中得到進一步證實[28]。同時p38MAPK活性通路介導的IL-6與BMPs通路之間存在負反饋環，提示IL-6激活可能是家族性PH合并BMPR2突變的主要原因。

1.3 IL-6調控miR-17/92信號通路誘發PH的形成 miRNAs是一類高度保守的內源性小非編碼RNA，在細胞增殖和分化過程中發揮重要作用，miR-17/92基因簇是第一個被發現的miRNA癌基因。研究表明，miR-17/92基因簇信號通路是PH在體內的關鍵調控因子，其在缺氧誘發PH中的表達成雙向性(早期呈誘導性表達、晚期表達降低)[29]。在一組動物實驗模型中發現，miR-17/92基因敲除小鼠可延緩缺氧誘發PH的進展，而再將miR-17/93基因重組到miR-17/93基因敲除小鼠中又加快了缺氧誘發PH的進展，且該實驗還證實miR-17z92基因對TGFb/Smad通路有正調控作用[30]。所以目前國內外對IL-6在肺血管重構中作用的研究主要關注IL-6對miR-17/92信號通路是否有直接或間接的調控作用[31]。

1.4 IL-6通過STAT3信號通路誘發VSMC增殖 IL-6的經典信號通路傳導與抗炎功能有關，而反式信號通路傳導則與促炎功能有關，IL-6的反式信號通路可誘導單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)產生，但IL-6需激活STAT3通路才能誘導MCP-1的表達，MCP-1在人體主要為血管內皮細胞釋放，其功能與內皮細胞炎癥及增殖有關。近年來有研究報道，IL-6的高表達可上調STAT3表達，最終誘導PASMC過度增殖和凋亡導致PH的發生[32]。在野百合堿誘發PH的大鼠實驗中發現，予野百合堿后2～4 d PY-STAT3過度激活，證實IL-6的表達與PY-STAT3激活程度呈正相關[33]，其機制可能是在IL-6刺激下STAT3的特異性酪氨酸殘基出現磷酸化并聚合，然后通過細胞質擴散到核孔區域并導入細胞核，從而激活靶基因轉錄[34-36]。但目前該機制僅在癌細胞的增殖中得到證實，是否為PH的主要機制目前尚不清楚[37]。

2 IL-6調控基因啟動子甲基化與GATA-6的關系

2.1 IL-6對基因啟動子甲基化的作用 DNA甲基化是表觀遺傳學基因調控的一種形式，當甲基化發生在調控區域時，其與轉錄因子的改變通常會導致靶基因表達受抑制。通常DNA甲基化發生在鳥嘌呤前的胞嘧啶殘基，即CpG島，甲基在DNA甲基轉移酶(Dnmts)催化下于CpG雙重蛋白內的胞嘧啶殘基中形成5甲基胞嘧啶而發揮作用，目前研究表明，DNA甲基化在胚胎發生和惡性腫瘤的生長中扮演著重要角色[38-39]。Dnmts是催化DNA甲基化的關鍵酶，包括Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b，其中Dnmt3a、Dnmt3b負責甲基化的建立，Dnmt1負責維持及修復DNA甲基化功能。DNA甲基化在IL-6介導的基因表達中發揮重要作用，其原因是IL-6通過誘導基因啟動子區CpG島的甲基化來下調靶基因的表達，導致靶基因沉默。既往研究發現，IL-6對Dnmt1啟動子及Dnmt1酶活性的調節有直接作用[40]。在胰腺癌細胞的增殖過程中觀察到，IL-6誘導的STAT3將Dnmt1集中到SOCS3啟動子位點，通過DNA甲基化抑制其轉錄[41]；在血管內皮細胞的生成中也可觀察到IL-6通過調控Dnmt1和Dnmt3b，從而誘導啟動子DNA甲基化來影響血管內皮細胞基因的表達[42]。Wehbe等[43]發現，膽管癌的生長需甲基化依賴的IL-6調控基因參與，同時IL-6還可通過影響其他酶的表達或活性來間接參與基因甲基化和轉錄調控蛋白的表達。

2.2 GATA-6基因在PH形成中的作用 近年來，GATA轉錄因子家族在細胞增殖中的作用受到高度重視[44]。GATA家族具有兩個特征性鋅指結構和特定的核苷酸序列,按表達方式的不同被分為兩個亞族。GATA-6是唯一表達于VSMC的GATA家族轉錄因子，由Tamura等[45]首次在兔胃組織中發現,其作用與調節PASMC表型轉化有關，同時GATA-6可抑制細胞進入細胞周期，能維持靜止期細胞表型的穩定性，即對平滑肌細胞的增殖與分化有重要的臨床意義。

2.2.1 關于血管平滑肌表型的轉化：1913年，Champy首次在體外培養出VSMC，并發現有2種功能截然不同的VSMC[46]，此后Chamley-Campbell等[47]提出兩種不同功能的VSMC可能是其分化狀態的兩個極端，并首次提出表型轉化的概念，即VSMC在來自胚胎發育時,首先分化為不同的細胞群并獲得具有成年特征的收縮表型,主要功能是促進及穩定血管的正常生理活動；當分化成熟后的VSMC在內外環境因素刺激下可發生去分化,成為分化程度較低的合成表型,表現為VSMC異常增殖、遷移、凋亡等。我們把VSMC從收縮表型轉化為合成表型并重獲增殖能力的過程稱為表型的轉化。

2.2.2 GATA-6在維持血管平滑肌表型中的作用：VSMC收縮表型中標志基因的表達有賴于血清反應因子(SRF)與位于這些基因啟動子和增強子內的CArG盒的結合，而SRF的表達又有賴于GATA-6的調控。在體外培養VSMC過程中發現，GATA-6 mRNA通過有絲分裂原的刺激和在增殖過程中過表達的GATA-6負反饋機制來實現細胞周期的阻滯，從而使VSMC生長停滯[48-49]。有數據表明，單獨敲除GATA-6基因可使平滑肌細胞保持收縮表型的能力降低60%[48]。在敲除GATA-6基因的小鼠中可觀察到肺動脈壓力明顯升高，并表現出血管肌化及肺部炎癥加強[49]。GATA-6基因腺病毒轉染平滑肌細胞的微點陣基因芯片分析表明，GATA-6轉錄因子也能激活ET-1的轉錄，促使血管平滑肌從收縮表型向合成表型轉化[48]。現有研究表明，GATA-6的表達對肺血流動力學的影響尤其重要，GATA-6的下調能明顯提高肺動脈壓力，而對動脈壓的增加無明顯作用，同時在野百合堿致大鼠缺氧模型和慢性缺氧小鼠模型中觀察到從損傷后第3天起肺GATA-6 mRNA水平便迅速下降，表明GATA-6表達變化可能是引起PH血管重構的早期病理過程[50]。在PH患者中，內皮細胞是CX3CL1的主要來源，而CX3CL1是大鼠GATA-6缺陷的血管內皮細胞中顯著上調的基因之一[51]，表明GATA-6的下調可能直接導致了炎性反應的發生。所以GATA-6在維持VSMC收縮表型的穩定性及調控VSMC的發育和分化中發揮重要作用。

2.3 IL-6與GATA-6可能的潛在關系 既往證據表明，平滑肌細胞DNA是否甲基化在血管平滑肌表型轉化中發揮重要作用，而表型的轉化決定著VSMC是否進行增殖[52]。雖然GATA-6在維持VSMC收縮表型的穩定性及調控VSMC的分化中發揮重要作用，但是IL-6誘導GATA-6啟動子區CpG島甲基化最終引起VSMC增殖/凋亡異常可阻斷這種作用。但目前IL-6誘導GATA-6啟動子區CpG島甲基化引起靶基因沉默來參與PASMC異常增殖這一機制還未被完全證實。

3 前景與展望

關于PASMC異常增殖，國內外已有學者開始研究IL-6在肺血管重構中的促進作用，但主要關注IL-6對信號通路的調控，而在炎癥狀態下，PASMC通過直接接受IL-6的刺激，并經IL-6對GATA-6基因啟動子進行甲基化修飾，使GATA-6失去對下游增殖及凋亡基因的調控，從而在PH肺血管重構中起重要作用的研究目前國內外尚未見報道。所以研究IL-6信號通路調控GATA-6基因啟動子甲基化在PASMC異常增殖中的作用尤為重要，這將為確定PH的發生機制和新的治療靶點提供理論基礎。