敲除NOR1基因對人肝癌裸鼠移植瘤的影響及作用機制

游 焜， 王大軍， 王 亮， 王建國

新鄉醫學院第一附屬醫院 肝膽外科， 河南 新鄉 453100

肝癌是臨床上發病率僅次于食管癌和胃癌的消化系統腫瘤，可分為原發性和繼發性，嚴重威脅人類健康[1]。原發性肝癌起源于肝臟的上皮或間葉組織，且原發性肝癌的發病是一個多因素的復雜過程，與HBV和HCV感染[2-3]、黃曲霉素[4]、酒精和非酒精因素導致的肝損傷[5-6]等因素有密切關聯。NOR1(oxidored-nitro domain containing protein1) 基因是由中南大學腫瘤研究所克隆的基因，定位于1p34.2,基因組DNA總長33.4 kb，包含11個外顯子，編碼389個氨基酸殘基，在人類組織中廣泛表達[7]。最近發現該基因與肝癌發生發展有著重要關系，研究[8]顯示，NOR1在人肝癌組織中表現出高表達水平，且敲除NOR1基因的小鼠對二乙基亞硝胺誘導肝癌產生抗性，抑制小鼠肝癌的發生發展，說明NOR1基因可能是肝癌相關的抑瘤、易感基因候選者。Notch基因最早發現于果蠅，Notch信號通路除了在調節細胞、組織、器官的分化和發育等方面發揮重要作用，還對多種腫瘤的發展起到調節作用[9-10]。近年來，使用RNA干擾技術進行基因治療及基因功能研究備受關注。本研究旨在探究敲除NOR1基因后對Notch信號通路活性、肝癌裸鼠移植瘤生長、模型裸鼠存活率以及細胞轉移的影響，為肝癌的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級雄性BALB/C裸鼠，4～6周齡，體質量16～20 g，共30只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限責任公司，許可證號[SCXK (湘) 2016-0002]；人肝癌細胞株HepG2購于中國科學院細胞庫；RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自武漢四季青生物制品公司；Lipofectamine 2000轉染質粒和siRNA購自日本TaKaRa公司；蘇木素伊紅染色試劑盒購自碧云天公司；EDTA抗原修復緩沖液購自福州邁新生物公司；DAB 顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物公司；RIPA裂解液購自碧云天公司；Ki-67、Caspase-3、Notch1、NICD、Hes1、Hey1抗體均購自英國Abcam公司。細胞培養箱購自美國Thermo公司，垂直電泳槽購自美國Bio-Rad公司。本方案經由新鄉醫學院第一附屬醫院實驗動物倫理委員會審批(批號：2018-12-5)，符合實驗室動物管理與實驗準則。

1.2 細胞培養及轉染 將人肝癌細胞株HepG2接種于含10%的胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養基，培養于37 ℃、含5% CO2培養箱，當細胞密度達到90%時進行傳代，待細胞狀態穩定后取對數期細胞用于后續試驗。將HepG2細胞培養于6孔板，待其生長密度達到50%時，將無序序列質粒 (Scramble) 和siNOR1質粒分別轉染至HepG2細胞。采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測轉染效率。操作步驟按照轉染試劑盒執行即可，48 h后用于后續試驗。

1.3 MTT檢測細胞增殖 將各組細胞接種于96孔板(100 μl/孔)，每組設3個復孔，置于37 ℃，含5% CO2細胞培養箱中培養24 h，每孔加入50 μL 1×MTT溶液，孵育4 h，吸出上清液，每孔加150 μl DMSO，用平板搖床搖勻，用酶標儀在570 nm處檢測各劑量OD值。

1.4 裸鼠肝癌皮下移植瘤模型的建立及分組 轉染后，將各組HepG2細胞密度調整為1×106個/ml，分別接種于裸鼠的腋窩皮下，并根據接種的細胞將大鼠隨機分為Control組、Scramble組和siNOR1組，各組10只。飼養30 d，記錄裸鼠死亡時間和個數，30 d取出存活裸鼠皮下移植瘤標本, 測量瘤的體積和質量。

1.5 石蠟切片 將各組小鼠頸椎脫臼處死后，取出瘤體及肝、腎、肺、腦剪切成5 mm ×5 mm×5 mm大小的組織塊浸泡于4%多聚甲醛中固定48 h，常規方法制作厚度為4 μm的石蠟切片。

1.6 免疫組化檢測 取上述裸鼠模型瘤體組織切片，并按常規方法進行脫蠟處理，滴加3%H2O2封閉過氧化物酶，使用0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液進行熱修復，5% BSA室溫封閉2 h，PBS清洗3次后分別孵育一抗Ki-67(1∶200)、Caspase-3(1∶500)，4 ℃封閉過夜，洗去一抗后孵育二抗，經DAB顯色后于顯微鏡下觀察并圖像采集。

1.7 Western Blot檢測 取各組模型裸鼠瘤體組織，并充分勻漿，使用預冷RIPA裂解液充分裂解后提取各組裸鼠瘤體組織總蛋白。經SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后，將蛋白轉印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，PBST洗脫后孵育一抗，4 ℃條件下孵育過夜，PBST洗脫一抗，加入對應二抗室溫下孵育2 h，PBST洗脫后，加入BCL，進行曝光，計算灰度值。

1.8 HE染色 取上述裸鼠模型各組織器官石蠟切片，分別在二甲苯中進行脫蠟，再經梯度酒精水化。將切片置于蘇木紫溶液中染色7 min后，蒸餾水洗凈后將切片放于0.5%鹽酸乙醇中30 s，自來水輕輕沖洗10 min，放入伊紅染液中浸泡3 min，蒸餾水浸泡，梯度酒精進行脫水后經二甲苯透明后滴加中性樹膠進行封片，顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 3組裸鼠質粒轉染效率比較 RT-PCR檢測結果顯示，siNOR1組NOR1敲除效率顯著低于Control組(P<0.05)(圖1)，表明NOR1敲除成功。

2.2 3組裸鼠細胞增殖情況比較 采用MTT檢測細胞增殖情況，結果顯示，siNOR1組第3、4、5、6天細胞增殖倍數顯著高于Control組(P值均<0.05)(圖2)。

2.3 3組裸鼠腫瘤體積與質量的比較 從建模第20天開始，與Control組相比，siNOR1組第20、25、30 天移植瘤體積顯著減小[(418.71±78.24)mm3vs (149.6.16±60.05)mm3、(864.22±125.66)mm3vs (239.83±100.51)mm3、(1468.45±199.78)mm3vs (446.54±147.09)mm3，P值均<0.05]；第30天時取出移植瘤，與Control組相比，siNOR1組移植瘤質量顯著減小[(0.45±0.07)g vs (0.12±0.04)g，P<0.05](圖3)。

2.4 3組裸鼠Ki-67、Caspase-3、Notch、NOR1陽性表達率的比較 與Control組相比，siNOR1組移植瘤組織中Ki-67、Notch、NOR1陽性表達率顯著降低[Ki-67：(48.98±9.75)% vs (11.51±5.09)%；Notch: (62.51±9.26)% vs (18.75±4.61)%；NOR1:(76.33±8.31)% vs (16.57±3.76)%,P值均<0.05]，Caspase-3陽性表達率顯著升高[(6.39±4.67)% vs (38.03±9.28)%,P<0.05](圖4)。

注：a,第30天時移植瘤大?。籦、c，與Control組比較，*P<0.05。

圖3敲除NOR1基因對移植瘤生長的影響

2.5 3組裸鼠生存率及Survivin蛋白表達量的比較 與Control組相比，siNOR1組模型裸鼠30 d內生存率顯著高于Control組[(77.66±6.75)% vs (25.32±4.63)%，χ2=6.897,P<0.05]；Western Blot檢測結果顯示，與Control組相比，siNOR1組Survivin蛋白表達水平顯著降低(0.34±0.06 vs 0.02±0.01,P<0.05)(圖5)。

2.6 3組裸鼠Notch1、NICD、Hes1、Hey1蛋白表達量的比較 Western Blot檢測結果顯示，與Control組相比，siNOR1組Notch1、NICD、Hes1、Hey1蛋白表達水平均顯著降低(Notch1：0.16±0.03 vs 0.03±0.01；NICD：0.26±0.05 vs 0.04±0.02；Hes1：0.35±0.04 vs 0.06±0.02；Hey: 0.29±0.06 vs 0.05±0.02，P值均<0.05)(圖6)。

2.7 3組裸鼠各器官損傷程度比較 Control組和Scramble組小鼠肝組織肝索紊亂，肝細胞呈大小不等的空泡樣變，嗜酸性變，可見小灶性壞死；局部腎小管擴張，腎小管上皮細胞有變性甚至壞死脫落，腎小管基底膜裸露；肺實質結構紊亂，肺泡腔內可見壞死細胞，肺泡間隔增寬且有炎癥細胞浸潤；腦中神經元胞核邊界不清，核仁腫脹或消失，核固縮濃染，空泡變性多，細胞間隙增大，呈無序排列。而siNOR1組中裸鼠各組織器官損傷情況均得到有效緩解(圖7)。

注：a，病理圖片(免疫組化，×400 )；b，與Control組比較，*P<0.05。

圖4敲除NOR1基因對Ki-67、Caspase-3、Notch、NOR1表達的影響

圖6敲除NOR1基因對Notch信號通路的影響

圖7裸鼠各器官病理圖片(HE染色，×400)

3 討論

原發性肝癌是常見的消化道惡性腫瘤疾病，但由于原發性肝癌的病因及確切分子機制尚不完全清楚，且各種治療手段存在局限性，肝癌患者的病死率較高，嚴重威脅人類健康[11]。近年來，肝癌綜合治療策略仍在不斷發展和細化中[12]。其中，Notch信號通路已被證明在多種癌癥中發揮調節作用，有望成為癌癥治療的關鍵通路[13]。而NOR1基因也已被證實在肝癌的發生發展中發揮重要作用，有望成為肝癌治療的靶基因。

本研究發現敲除NOR1基因后人肝癌HepG2細胞移植瘤生長受到顯著促進，同時Ki-67表達水平顯著下降，Caspase-3表達水平顯著升高。在惡性腫瘤中，細胞不受控制的增殖是腫瘤形成的關鍵原因。Ki-67是分布于細胞核內與增殖相關的關鍵蛋白，與細胞的有絲分裂密切相關，是反應腫瘤細胞分裂增殖的標志物[14]。細胞凋亡是細胞在一定生理或病理條件下的程序性死亡，可有序去除受損細胞，在腫瘤的發生發展中可以發揮抑制腫瘤細胞生長作用[15]。Caspase是細胞凋亡的關鍵蛋白酶家族，并參與細胞的生長、分化與凋亡調節[16]。其中Caspase-3是Caspase家族中的重要一員。有研究[17]顯示，NOR1基因過表達可改變PDK1表達和線粒體Bax-Bcl2平衡從而抑制腫瘤細胞對缺氧的適應，引起鼻咽癌細胞在缺氧環境凋亡,發揮出抑癌作用。相反，Xiang等[18]研究顯示，NOR1基因在肝癌細胞表現出高表達NOR1水平，可能作為肝癌的抑制基因發揮作用。結合已有研究，NOR1基因可能在不同的腫瘤細胞中發揮不同的作用，而在肝癌細胞中NOR1基因可能發揮抑癌作用，抑制肝癌的發生發展。

本實驗結果顯示，敲除NOR1基因可顯著下調Survivin蛋白和Notch信號通路下游Notch1、NICD、Hes1和Hey1蛋白表達水平，并且敲除NOR1基因移植瘤裸鼠30 d內存活率顯著高于NOR1基因高表達移植瘤裸鼠。存活蛋白Survivin是凋亡抑制蛋白家族成員，只表達于腫瘤和胚胎組織，參與控制細胞分裂并抑制細胞凋亡，與肝癌的浸潤或遠處轉移等惡性發展密切相關, 可作為肝癌基因治療的新靶點[19]。Notch信號可通過相鄰細胞之間的相互作用進而發揮對細胞增殖分化、器官發育的調控作用[20]。有研究[21]顯示，Survivin蛋白在人肝癌組織中高表達，而在正常肝組織中沒有存活蛋白的表達，且Survivin高表達患者的生存時間顯著低于低表達患者。You等[22]發現，過表達NOR1基因可上調Notch信號通路下游Notch1、NICD、Hes1和Hey1蛋白表達水平，顯著提升HepG2或Hep3 B淋巴細胞的增殖和遷移能力。結合已有研究，本研究結果提示，敲除NOR1基因可通過Notch信號通路抑制HepG2細胞移植瘤生長。

腫瘤細胞黏附性降低是惡性腫瘤發生轉移侵入周遭正常組織的重要特征，也是腫瘤治療中的關鍵。在腫瘤細胞的轉移過程中，腫瘤細胞分泌特殊物質，溶解及破壞周圍組織，引起侵襲部位炎癥反應，造成組織損傷[23]。有研究[24]顯示，肝細胞核因子1β可通過激活Notch信號通路促進肝癌細胞向肝癌干細胞分化，增強肝癌細胞的侵襲和轉移能力。本研究結果顯示，Control組和 Scramble組裸鼠的肝、腎、肺、腦均有不同程度的組織損傷，而敲除NOR1基因后組織損傷均好轉。提示，敲除NOR1基因可抑制HepG2細胞侵襲轉移。

綜上所述，敲除NOR1基因可有效下調Notch信號通路下游蛋白及Survivin蛋白表達水平，進而抑制HepG2細胞裸鼠移植瘤生長，提高裸鼠模型生存率，抑制HepG2細胞侵襲轉移。接下來筆者團隊將進一步探究NOR1基因及Notch信號通路對HepG2細胞上皮間質轉換、侵襲以及向肝癌干細胞分化的影響。