內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的信號通路及其與肝臟疾病的關(guān)系

李 姚， 王志鑫， 溫 浩， 王海久， 才讓東智， 于文昊， 張 麗， 樊海寧

1 青海大學(xué)研究生院， 西寧 810000； 2 青海大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽胰外科， 西寧 810000；3 青海省包蟲病研究重點實驗室， 西寧 810000； 4 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 烏魯木齊 830001

1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)及相關(guān)通路

1.1 生物學(xué)特性 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是哺乳動物一種重要的細胞器，其膜結(jié)構(gòu)占細胞內(nèi)膜的1/2，在內(nèi)膜系統(tǒng)中也占有重要中心地位。ERS一方面是為了激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)以抵制應(yīng)激誘因造成的有害影響，另一方面UPR不足時可以重建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，UPR信號通路是通過細胞凋亡途徑而引起細胞損傷甚至死亡[1]。各種損傷因素作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，引起蛋白質(zhì)加工/運輸障礙或攝取/釋放Ca2+障礙，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯誤折疊與未折疊蛋白聚集以及細胞內(nèi)Ca2+平衡紊亂，進而激活UPR。UPR可通過某些特定基因的轉(zhuǎn)錄而增強蛋白質(zhì)折疊的能力，保持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，維持細胞正常功能[2],當(dāng)穩(wěn)態(tài)不能重建時，UPR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將引發(fā)細胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上存在3種感受腔內(nèi)未折疊蛋白堆積的感受器蛋白：蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、肌醇需求酶1(IRE-1)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)[3]。

1.2 ERS的3種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

1.2.1 PERK通路 PERK是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一種Ⅰ型跨膜蛋白，是真核起始因子2α (eIF2α)激酶家族成員之一。在正常情況下，PERK作為單體存在，處于非活性狀態(tài)，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78/BiP結(jié)合。ERS發(fā)生時，BiP與PERK解離[4]，PERK通過低聚和反式自磷酸化激活。激活磷酸化eTF2α，導(dǎo)致平動衰減。磷酸化eIF2α翻譯激活活化的轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)mRNA和ATF且誘發(fā)UPR目標(biāo)基因的表達，參與氨基酸代謝、抗氧化反應(yīng)、ERS誘導(dǎo)凋亡[3,5]。其中ATF4是環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(CREB)家族成員，能結(jié)合ATF/CRE元件序列5′-TGACGTCA-3′和氨基酸反應(yīng)元件的核心序列5′-ATTGCATCA-3′，可進一步調(diào)控GRP78、GRP94、GADD34、CHOP、ATF3、P58IPK、EDEM及PDI等的表達[6-7]。并且產(chǎn)生的GADD34可與絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶的抑制劑形成復(fù)合物，促進eIF2α去磷酸化，恢復(fù)蛋白質(zhì)合成，從而形成負反饋調(diào)節(jié)環(huán)[7]。

1.2.2 IRE-1通路 IRE-1是一種具有RNase結(jié)構(gòu)域的Ⅰ型跨膜蛋白，帶有絲-蘇氨酸激酶和核酸內(nèi)切酶的活性， 包括IRE-1α和IRE-1β兩種亞型。在正常情況下，IRE-1通過與BiP結(jié)合而作為單體存在。在ERS下，BiP與IRE-1解離，IRE-1通過低聚和反應(yīng)自磷酸化被激活。激活的IRE-1啟動其RNase活性，催化非常規(guī)剪接X盒結(jié)合蛋白1(X-box-binding protein-1，XBP1)mRNA，合成剪接的活性轉(zhuǎn)錄因子[8], XBP1屬于CREB/活化轉(zhuǎn)錄因子家族成員。 XBP1誘導(dǎo)參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解(endoplasmic reticulum-associated degradation，ERAD)和脂質(zhì)合成的UPR靶基因表達以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白的表達[3,9]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn) IRE-1α或 XBPl 敲除的細胞會表現(xiàn)出ERAD方面的功能缺失，說明IRE-1α/XBP1信號通路與ERAD功能有關(guān)。

1.2.3 ATF6通路 ATF6是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一種Ⅱ型跨膜蛋白，是一種堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子[10]。ATF6包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)3個結(jié)構(gòu)域，其N端駐留于胞質(zhì)中，有一個bZIP的DNA轉(zhuǎn)錄激活域；C端駐留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，能夠感應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中未折疊蛋白聚集傳來的信號[11]。在正常情況下，由于ATF6的高爾基定位信號被BiP覆蓋，抑制了ATF6向高爾基體的易位。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫下，ATF6從BiP中釋放并轉(zhuǎn)移到高爾基體。在高爾基體中，ATF6被位點1蛋白酶和位點2蛋白酶裂解[12]，然后ATF6的功能片段被釋放到胞質(zhì)中[13]。這個片段轉(zhuǎn)移到細胞核，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白、ERAD和 XBP1的表達。

2 ERS與乙型肝炎

乙型肝炎是由HBV感染引起的肝臟炎性狀態(tài)，常是肝細胞癌(HCC)的發(fā)病機制[14]。雖然已有許多關(guān)于HBV在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肝炎、肝硬化、HCC等發(fā)病機制中的報道，但其機制尚未完全了解。到目前為止，有關(guān)ERS介導(dǎo)HBV突變的綜述僅限于一種特定的突變型: preS2缺失。

許多研究認為preS突變體(LHBs和MHBs)在肝臟疾病中的作用機制與ERS明顯相關(guān)。preS1和preS2突變體都有分泌表面蛋白的缺陷，這種突變體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累導(dǎo)致磨玻璃肝細胞的形成，這是慢性乙型肝炎感染的組織學(xué)標(biāo)志。Pollicino等[15]篩選了40例未經(jīng)治療的慢性乙型肝炎患者，其中有14例(35%)患者表現(xiàn)出單一或多個preS/S突變。他們發(fā)現(xiàn)preS/S突變體和分泌HBsAg水平呈負相關(guān)。在最近的一項研究中，Montalbano等[16]證實了被ERS信號激活轉(zhuǎn)染的肝細胞(Huh7和HepG2細胞)含有包含HBV的突變包膜蛋白(pSVL質(zhì)粒在preS1中發(fā)生突變，pSVM質(zhì)粒在preS2中發(fā)生突變)。免疫熒光顯微鏡顯示LHBs在兩種細胞系中均定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，僅有部分MHBs共定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔；該研究還表明，LHBs和HBsAg的比例對于HBsAg和病毒粒子的分泌是必要條件之一。在這方面，Ou等[17]也發(fā)現(xiàn)過表達含有preS1的LHBs阻礙了HBsAg的分泌。Bock等[18]檢測了3種preS區(qū)域的自然突變:MUT1(CCAAT box中的一個點突變)、MUT2 (CCAAT盒中的一個6 bp缺失)和MUT3 (preS2區(qū)域中的一個153 bp缺失)。他們在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)現(xiàn)了突變S蛋白的積累。此外，Ou等[17]報道了pSVL和pSVM質(zhì)粒提高了GRP78和CHOP在Huh7細胞系中的表達，IRE-1α和ATF4水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化，免疫熒光數(shù)據(jù)同樣顯示GRP78增加。此外，Huh7在轉(zhuǎn)染pSVM的細胞時GRP78的表達水平增加了2.0倍，pSVL組表達水平無明顯變化。與陽性對照細胞和TG-treated細胞相比，pSVM和pSML轉(zhuǎn)染的Huh7細胞顯示XBP1被激活。不僅IRE-1α/XBP1被激活，而且PERK也被pSVL和pSVM激活，PERK和eIF2α的磷酸化高度增加。這些數(shù)據(jù)表明突變的HBV包膜蛋白激活了肝細胞ERS通路。在HBV感染者中，ERS介導(dǎo)乙型肝炎可以歸納為3個方面:(1)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中存在preS1和preS2突變體并誘導(dǎo)ERS，同時誘導(dǎo)ERS伴侶GRP78升高起到保護作用；(2) preS突變會影響S基因的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致乙型肝炎的發(fā)生；(3)HBV基因組突變可產(chǎn)生多種HBV編碼蛋白的突變類型，這些突變主要通過增加突變蛋白的積累來增強受感染肝細胞的ERS。總體而言，了解HBV如何誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷及其機制將為慢性乙型肝炎患者提供新的治療選擇。

3 ERS與肝衰竭

肝衰竭包括急性肝衰竭、亞急性肝衰竭、慢加急性(亞急性)肝衰竭和慢性肝衰竭。肝衰竭為當(dāng)今國內(nèi)外研究的難點，其發(fā)病機制仍未完全明確。張向穎等[19]應(yīng)用D-氨基半乳糖( D-GalN )和脂多糖(LPS)誘導(dǎo)大鼠肝衰竭模型，對照組同步注射等體積的生理鹽水進行比較。通過采用免疫組化及RT-PCR方法檢測兩組肝組織Caspase-12、IRE-1、NF-κB、NF-κB誘導(dǎo)的激酶(NIK)表達情況，采用常規(guī)HE染色、流式細胞技術(shù)觀察肝細胞凋亡情況,分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白IRE-1與肝細胞凋亡程度、Caspase-12的相互關(guān)系及Caspase-12與肝細胞凋亡程度的相互關(guān)系，結(jié)果表明隨著肝臟病理損傷的加重肝組織中IRE-1α、Caspase-12表達增加,IRE-1α與Caspase-12、細胞凋亡率以及Caspase-12與細胞凋亡率均呈明顯正相關(guān), IRE-1α/ TRAF2/ Caspase-12介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是ERS導(dǎo)致暴發(fā)性肝衰竭中肝細胞凋亡的重要機制之一。在暴發(fā)性肝衰竭中,隨著肝臟病理損傷的加重肝組織中NF-κB表達增加,且與肝細胞凋亡率呈明顯正相關(guān),從細胞、蛋白、基因水平證實NF-κB在暴發(fā)性肝衰竭肝細胞凋亡中起重要作用。并且證明了肝衰竭肝組織中NF-κB p65與IRE-1α呈明顯正相關(guān),但與NIK之間無相關(guān)性。提示NF-κB可能在ERS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起重要作用,但在IRE-1α/TRAF2/NF-κB這一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中,連接TRAF2與NF-κB的信號轉(zhuǎn)錄分子NIK對NF-κB p65無明確調(diào)控作用。

最近有研究[20]發(fā)現(xiàn)在四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的小鼠肝衰竭模型中，肝臟 NF-κB p65 易位和eIF2α磷酸化顯著增加，ERS抑制劑4-基丁酸干預(yù)后可以明顯抑制小鼠肝損傷。在 N-乙酰氨基酚(APAP) 誘導(dǎo)的藥物性肝衰竭中，APAP能夠誘導(dǎo)ERS肝損傷和肝細胞死亡，ERS特異性凋亡基因CHOP敲除小鼠進行膽管結(jié)扎，肝臟炎癥反應(yīng)激活，4-基丁酸抑制ERS顯著改善 APAP誘導(dǎo)的小鼠肝損傷。CCl4誘導(dǎo)的藥物性急性肝衰竭小鼠模型中，ATF4 減少促進急性肝損傷。在慢性乙型肝炎重癥化引發(fā)的慢加急性肝衰竭中，ERS誘導(dǎo)保護性的UPR在慢性乙型肝炎中被激活，而在肝衰竭期間則失活，但是嚴(yán)重ERS誘導(dǎo)的相關(guān)凋亡蛋白隨著肝衰竭發(fā)生而逐漸高表達；動物實驗[21]表明，ERS在 D-GalN / LPS 誘導(dǎo)的急性肝衰竭動物模型中被引發(fā)，4-苯基丁酸抑制ERS可以顯著抑制炎癥反應(yīng)并減輕急性肝衰竭肝損傷，細胞實驗表明，ERS協(xié)同 LPS 激活 Toll樣受體4，誘導(dǎo)促炎因子的大量產(chǎn)生。綜上所述，在肝衰竭患者中，ERS相關(guān)伴侶蛋白的表達增加與ERS參與暴發(fā)性肝衰竭肝細胞凋亡的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。ERS在肝損傷方面起到保護作用，抑制ERS可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，降低肝損傷發(fā)生率。ERS是肝衰竭參與機制之一，有利于研究出更多治療肝衰竭的方法。

4 ERS與HCC

ERS促進腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)測，潛在的具體機制仍然未知[22]。Liu等[23]研究證明ERS誘導(dǎo)HCC細胞釋放外泌體，外泌體通過調(diào)節(jié)程序性死亡配體1(PD-L1)的表達來減弱抗腫瘤免疫。ERS的標(biāo)志物GRP78、ATF6、TRE-1α在HCC組織中表達上調(diào)并與HCC患者的總生存期和AFP臨床評分呈負相關(guān)。ERS相關(guān)蛋白表達與HCC組織CD68+巨噬細胞募集及巨噬細胞PD-L1表達呈正相關(guān)。定量PCR分析經(jīng)衣霉素處理的HCC細胞中miRNA-23a-3p(外泌體中最豐富的miRNA之一)，其水平與總生存率呈負相關(guān)。外泌體衣霉素處理組可上調(diào)巨噬細胞中PD-L1的體內(nèi)外表達。生物信息學(xué)分析表明，miRNA-23a-3p通過磷酸酶和緊張素同源物(PTEN)-磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶(PI3K/PKB)通路調(diào)控PD-L1表達。體外轉(zhuǎn)染和共培養(yǎng)實驗顯示miRNA-23a-3p抑制了巨噬細胞中PTEN的表達。Huang等[24]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可誘導(dǎo)人癌細胞中ATF6、ATF4和CHOP等表達增高，引起細胞凋亡。日柏醇可誘導(dǎo)人癌細胞中UPR信號通路相關(guān)基因表達，促使細胞發(fā)生凋亡[25]。HCC細胞HepG2在衣霉素誘導(dǎo)下發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)且細胞凋亡增多，進一步說明了ERS在誘導(dǎo)HCC細胞凋亡中的作用。Jin等[26]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠給予六價鉻喂養(yǎng)后，取肝組織檢測顯示GRP78、ATF6和CHOP不僅與索拉非尼在HCC治療中產(chǎn)生耐藥有關(guān)，還影響著抗腫瘤藥物對HCC的治療效果[27]。Guo等[28]報道，ERS中CHOP途徑在山奈酚誘導(dǎo)的HCC細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，抑制劑的作用下HCC細胞可免受ERS誘導(dǎo)的細胞凋亡。總結(jié)ERS在HCC中產(chǎn)生的機制：(1)ERS誘導(dǎo)HCC細胞釋放外泌體，外泌體通過調(diào)節(jié)巨噬細胞PD-L1的表達來減弱抗腫瘤免疫；(2)ERS在HCC細胞中釋放外泌體，上調(diào)巨噬細胞中PD-L1的表達，進而通過miRNA-23a-PTEN-AKT外泌體途徑抑制T淋巴細胞功能。(3)HCC可通過激活UPR來順應(yīng)各種不利環(huán)境，促進HCC適應(yīng)缺氧環(huán)境，有利于腫瘤細胞的存活。因此，ERS的發(fā)生及其誘導(dǎo)HCC細胞凋亡機制有可能為研究新的抗肝癌靶點提供新思路。

5 ERS與肝棘球蚴病

肝包蟲病是牧區(qū)較常見的寄生蟲病，亦稱肝棘球蚴病，此病仍然是一個公共衛(wèi)生問題，分布于世界范圍內(nèi)。阿苯達唑是目前唯一用于包蟲病術(shù)前術(shù)后的口服藥物。然而，由于其療效低、并發(fā)癥多，找到新的治療藥物成為世界級挑戰(zhàn)[29]。Nicolao等[30]發(fā)現(xiàn)硼替佐米(bortezomib，BTZ)分別在5 μmol/L和0.1 μmol/L濃度下對囊型包蟲病小鼠的原頭節(jié)和后絳幼蟲存在影響，結(jié)果顯示在小鼠接觸藥物96 h后殺死了50%的幼蟲;使用BTZ 8 d后原頭蚴死亡率為100%，其半抑制濃度(IC50)為(14±3)μmol/L。BTZ目前作為一種用于骨髓瘤化療的蛋白酶體抑制劑，研究表明在0.6 μmol/L的半最大效應(yīng)濃度(EC50)劑量下對多房棘球蚴蟲具有高水平的殺傷作用。BTZ處理的多房棘球蚴會導(dǎo)致泛素化蛋白的積累和寄生蟲死亡[31]。寄生蟲細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的蛋白酶體可能是靶點，因為其參與細胞分化、增殖、包囊形成、幼蟲侵襲的調(diào)控。抑制蛋白酶體干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，影響蛋白質(zhì)的折疊，并通過轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)ERS相關(guān)標(biāo)志物的表達。在真核生物進化過程中，UPR傳感器增加時只有IRE-1/XBP1在酵母菌中發(fā)出信號。在秀麗隱桿線蟲和黑腹線蟲中，有3個分支在它們的基因組中編碼，但只有2個是功能性的(IRE-1/XBP1和PEK1)，而在哺乳動物中IRE-1、PERK和ATF6通路均可在ERS中調(diào)節(jié)穩(wěn)態(tài)[32-33]。特別是缺乏內(nèi)質(zhì)網(wǎng)傳感器IRE-1/XBP1和ATF6的細胞內(nèi)寄生蟲，如利什曼原蟲、弓形蟲和錐蟲等，同樣通過PERK識別錯誤折疊的蛋白進行UPR。Mori[34]通過對棘球絳蟲基因組的生物信息學(xué)和轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)棘球蚴可能具有所有這些功能蛋白。Nicolao等[30]通過RT-PCR和real-time PCR也展示了UPR信號IRE-2和XBP1基因在細粒棘球絳蟲原節(jié)段中的表達并觀察到BTZ治療后的上調(diào)，證明了BTZ對寄生蟲的有害作用，UPR的激活加劇了寄生蟲的死亡；研究還表明，在正常生長條件下，Eg-GRP78和Eg-calnexin基因在兩種幼蟲形態(tài)中均表現(xiàn)出較高的基礎(chǔ)表達水平，而在BTZ處理后的原頭蚴中僅表現(xiàn)出顯著的基因上調(diào)，證實了ERS和UPR的激活。令人驚奇的是，在蛋白質(zhì)合成速率超過原節(jié)段的元莢體細胞，Eg-GRP78等伴侶蛋白在BTZ反應(yīng)下的表達增加并不明顯。因此，在這種幼蟲形態(tài)中，伴侶蛋白和UPR轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的低表達可以解釋BTZ在低濃度下的高敏感性。ERS與肝包蟲病研究內(nèi)容仍然缺乏，上述只能證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白和UPR轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白mRNA的增加以及BTZ誘導(dǎo)細粒棘球絳蟲產(chǎn)生ERS和自噬。希望在不久的將來，ERS機制及其藥理調(diào)控途徑能成為治療肝包蟲病的新思路。

6 小結(jié)

綜上所述，ERS過程復(fù)雜，其在肝臟疾病中扮演著重要角色。ERS可以保護細胞，避免未折疊蛋白過多而使肝組織發(fā)生病理損傷。如UPR可通過某些特定基因的轉(zhuǎn)錄而增強蛋白質(zhì)折疊的能力，保持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，維持細胞的正常功能。當(dāng)UPR不足時，外源性刺激則會導(dǎo)致肝細胞的損傷。目前，ERS的許多方面尚不清楚，隨著對ERS與肝臟疾病關(guān)系的研究逐漸深入，有助于從細胞及分子水平進一步了解肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展機制，為探索肝臟疾病的免疫治療提供新的策略。