循環游離DNA在肝癌和肝相關性寄生蟲病中的應用進展

后亞軍， 張靈強， 樊海寧

1 青海大學 研究生院， 西寧 810000； 2 青海大學附屬醫院 肝膽胰外科， 西寧 810000；3 青海省包蟲病重點研究實驗室， 西寧 810000

Mandeld等[1]在1948年首次報道循環游離DNA(circulating free DNA，cf-DNA)，是指在非細胞成分中發現DNA片段。這一發現的意義幾十年來一直不為人所知。直到1977年，Leon[2]發現癌癥患者的血液中cf-DNA濃度增加。10年后，Stroun等[3]發現cf-DNA來源于癌細胞，這一結果得到了Sorenson等[4]的驗證，該研究通過等位基因特異性聚合酶鏈式反應(PCR)在血漿cf-DNA檢測出突變的KRAS癌基因序列。經過多半個世紀的研究，為cf-DNA的臨床應用打開了大門。

1 cf-DNA的來源

目前研究[5]發現，cf-DNA通過細胞凋亡和壞死被釋放到血液循環中，或通過活性細胞分泌以及寄生蟲感染導致免疫反應引起的炎癥衍生DNA片段進入血液循環中。此外，cf-DNA在其他體液中也有發現(包括唾液、腦脊液及尿液等體液中)[6-9]。最初認為血液中較高水平的cf-DNA可能是腫瘤生長的指標[2]，但正常人循環中也存在較低水平cf-DNA(平均10～15 ng/ml)，在組織應激條件下可升高，包括運動、炎癥、組織損傷等[10]。

2 cf-DNA的分離和檢測

由于疾病源性cf-DNA水平低，半衰期短，需要對cf-DNA進行專門的分離和檢測。目前主要的分離方法有：相分離法、基于硅膜的旋轉柱技術和基于磁珠的分級篩選法[11-12]。Campos等[13]提出了一種新型的微流控固相萃取裝置用于cf-DNA的分離，該方法具有操作簡便、成本低等優勢。目前檢測cf-DNA的方法主要有兩種，一種方法是靶向DNA測序技術，如數字PCR(dPCR)、液滴PCR(ddPCR)、巢式PCR(nested PCR)、實時PCR(real-time PCR)，深度測序以及靶向糾錯測序等[14-16]；另一種檢測方法是非靶向第二代測序技術，如全基因測序、全外顯子組測序等[17]。

3 cf-DNA在肝癌中的應用

精準醫療在腫瘤學應用的關鍵目標是提高癌癥的診斷和治療水平[18]。在癌癥患者中，從腫瘤細胞中釋放出來的cf-DNA通常被稱為循環腫瘤DNA(circulating free tumor DNA，ct-DNA)，ct-DNA在整個cf-DNA中的占比差異很大，從小于0.1%到大于90%不等[19]。由于腫瘤異質性的存在穿刺組織活檢很難反映癌癥基因組全貌[20]，有證據[21]表明ct-DNA提供了較全腫瘤基因組信息，因為它呈現了從多個腫瘤區域釋放入循環中的DNA或者來自不同腫瘤病灶的腫瘤相關循環DNA。總之，ct-DNA的這些特征使其在精準腫瘤醫學應用中成為有前景的分析物。

肝癌已成為中國人群過早死亡的第五大原因[22]。大多數肝癌患者就診時已進展到中晚期，預后極差[23]。因此，開發精準分子檢查工具至關重要。Xu等[24]通過比較肝癌組織和正常血液白細胞，確定了肝癌特異性甲基化標記板，并發現肝癌相關基因和與之匹配的血漿ct-DNA的甲基化特征呈高度相關，且與腫瘤負擔、治療反應和分期密切相關。該研究表明ct-DNA甲基化標志物在肝癌的診斷、監測和預后中的實用性。近期Cai等[25]通過對cf-DNA中5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosines，5hmC)的全基因組定位，發現并驗證5hmC-Seal技術是一種高靈敏的表觀遺傳學工具，可用于早期肝癌的診斷。cf-DNA在肝癌中的應用，因其非侵入、可靠的生物標志物等特性，可以補充并最終取代侵襲性肝穿刺活檢，用于肝癌的診斷、分期、療效評價以及預后分析。同時，在疾病的早期發現肝癌，并行根治性切除，這對于提高患者的生存率至關重要。

4 cf-DNA在肝相關性寄生蟲病中的應用

cf-DNA作為生物學標志物應用于肝相關性寄生蟲疾病的檢測是一個相對較新的概念，雖然cf-DNA檢測在寄生蟲學領域的應用沒有像在腫瘤學領域發展迅速，但該方法可能對未來肝相關性寄生蟲病的診斷和控制具有重要作用。目前用于診斷寄生蟲病的方法中，宿主體液中檢測寄生蟲cf-DNA具有良好前景。迄今為止，cf-DNA已應用于瘧疾[26]、阿米巴肝膿腫[27]、血吸蟲[28]以及肝棘球蚴[29]等累及肝寄生蟲疾病的檢測中。

4.1 瘧疾 瘧原蟲是導致瘧疾的病原體。盡管血液涂片的顯微鏡檢查仍然是瘧疾診斷的“金標準”，但使用PCR進行分子檢測因其靈敏度和快速診斷性在瘧原蟲診斷中越來越受歡迎。在早期研究中，Gal等[26]首次報道瘧疾患者的血漿中存在瘧原蟲源性cf-DNA，共采集了10例瘧疾患者的血樣，其中6例瘧疾患者血液涂片鏡檢均為陽性，血漿PCR檢測均為陽性。2例瘧疾患者顯微鏡檢查呈陰性，血漿PCR檢測呈陽性。2例瘧疾治愈的患者，顯微鏡檢查和血漿PCR檢測均為陰性，血漿中瘧原蟲源性cf-DNA的定量測定可能是診斷瘧疾和評價瘧疾預后的潛在指標。研究[30]表明，利用PCR技術可在唾液和尿液中檢測到瘧原蟲源性cf-DNA。Ghayour等[31]采用巢式PCR技術，對惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲的唾液、尿液和血液樣本進行線粒體細胞色素B基因定位，結果顯示，巢床PCR對瘧原蟲混合種感染的診斷比血涂片顯微鏡檢更為敏感。唾液和尿液樣品的巢床PCR擴增結果顯示，唾液樣品更準確。因此，在需要重復取樣的瘧疾診斷中，唾液可以作為血液的替代品。

4.2 阿米巴肝膿腫 阿米巴肝膿腫是由于溶組織內阿米巴突破黏膜屏障，經門靜脈循環進入肝臟引起的肝膿腫[32]。未及時診治的阿米巴肝膿腫是導致阿米巴患者死亡的主要因素。由于阿米巴肝膿腫與化膿性肝膿腫在血清學及影像學檢查較難鑒別，易導致病情延誤。Parija等[27]首次報道由于阿米巴肝膿腫患者的腎臟濾過屏障對溶組織內阿米巴DNA具有滲透性，通過PCR技術對疑似患者尿液檢測有助于阿米巴肝膿腫的診斷，也可為經甲硝唑治療后阿米巴肝膿腫患者預后評估提供幫助。Haque等[33]研究表明，在阿米巴肝膿腫患者的血液、唾液及尿液中應用實時PCR技術檢測到了溶組織內阿米巴相關cf-DNA，但唾液和尿液檢出率優于血液。cf-DNA檢測技術為阿米巴肝膿腫的診斷以及療效評價提供了新的方法。

4.3 血吸蟲病 cf-DNA作為診斷工具已用于血吸蟲患者的血漿、血清和其他體液(如唾液、尿液)的檢測[28,34]。檢測cf-DNA的臨床樣本獲取方便，克服了使用Kato-Katz方法收集糞便樣本和進行顯微鏡檢查的實際困難和低精確度。因此，cf-DNA檢測經常被用于血吸蟲病篩選的敏感項目[35]。最近的研究進一步證明，與顯微鏡檢查相比，人糞便樣品定量PCR檢測可提高診斷準確性。這種cf-DNA可能來源于成蟲或蟲卵。然而，尚不清楚成蟲DNA如何從循環中進入腸道[36]。 實際上，與Kato-Katz檢測相比，血吸蟲相關cf-DNA檢測有更高的準確性[37]。 此外，研究[38]表明,宿主血清檢測血吸蟲cf-DNA，在動物模型感染的早期階段就可以進行陽性診斷。 使用cf-DNA檢測能發現早期感染，有利于早期治療，這將為血吸蟲患者的治療提供機會，而不會發展成慢性疾病。

4.4 肝棘球蚴病 肝棘球蚴病包括由細粒棘球蚴絳蟲感染引起的肝囊型包蟲病和多房棘球蚴絳蟲感染引起肝泡型包蟲病。目前，該病的診斷方法主要有影像學及血清學檢查，影像學檢查的挑戰在于對微小病灶(<2 cm)診斷存在困難，血清學檢測的局限是感染人群中有一部分患者無包蟲病陽性血清學標志物，cf-DNA用于棘球蚴病診斷有望提供新的途徑[29]。Chaya等[39]首次應用PCR技術檢測囊液、血清和尿液中細粒棘球蚴特異性核酸用于囊型包蟲病的診斷，研究結果表明，PCR對棘球蚴囊液中細粒棘球蚴特異性DNA的檢測是高度敏感的，在囊型包蟲病囊泡破裂的患者血清中檢測同樣具有高度敏感性(可能與囊泡破裂特異性DNA進入血液循環有關)。Baraquin等[40]報道，首次確定在泡型包蟲病患者、泡型包蟲病動物模型中存在cf-DNA。豐富了泡型包蟲病的分子學診斷方法，但由于該研究患者中檢測到的cf-DNA濃度極低，可能與樣本量、樣本提取以及樣本的性質(該研究從血清中提取cf-DNA，腫瘤研究中多在血漿中提取)有關，此外關于特定的寄生序列是否優先被釋放有待進一步研究。

5 總結

cf-DNA檢測技術在肝癌領域和肝相關性寄生蟲感染領域有著廣泛的應用前景。但是，有效臨床應用cf-DNA檢測技術需要準確理解這種技術的優點和局限性，同時也要標準化該技術的檢測方法，以便正確解釋結果，以指導臨床決策。此外，cf-DNA檢測技術應用于肝相關性寄生蟲疾病診斷相對不成熟，還需要進一步的改進，特別是在改進DNA提取方法的同時降低檢測成本，以及提高診斷準確性和實用性。