原發(fā)性膽汁性膽管炎相關(guān)細(xì)胞因子的研究進展

黃志琴， 黃會芳

1 山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，太原 030000； 2 山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 消化內(nèi)科， 太原 030000

免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子在固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答過程中參與PBC的發(fā)生發(fā)展。 細(xì)胞因子指在細(xì)胞信號傳導(dǎo)中起介導(dǎo)作用的蛋白質(zhì)，包括IL、IFN、TNF、集落刺激因子、趨化因子、生長因子、TGFβ家族等。 PBC患者肝組織門靜脈匯管區(qū)CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤明顯增多；CD4+T淋巴細(xì)胞在不同細(xì)胞因子的刺激下分化為輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)1、Th2、Th9、Th17、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)等，這些CD4+T淋巴細(xì)胞亞群可進一步分泌多種細(xì)胞因子介導(dǎo)肝臟炎癥過程[4]。同時，CD8+T淋巴細(xì)胞在CD4+T淋巴細(xì)胞的輔助下，通過表達(dá)自殺相關(guān)因子(factor associated suicide，F(xiàn)as)、IFNγ發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。B淋巴細(xì)胞也可在CD4+T淋巴細(xì)胞的輔助下，分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生AMA。對于天然免疫細(xì)胞，PBC患者單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也明顯增多[4]，同樣通過分泌多種細(xì)胞因子介導(dǎo)肝臟炎癥過程，而自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)、自然殺傷T淋巴細(xì)胞(NKT細(xì)胞)通過分泌穿孔素、自殺相關(guān)因子配體(factor associated suicide ligand，F(xiàn)asL)、IFNγ介導(dǎo)BEC損傷。因此，免疫細(xì)胞與細(xì)胞因子緊密聯(lián)系，共同參與PBC的免疫調(diào)節(jié)。

1 細(xì)胞因子在PBC中的作用

鑒于細(xì)胞因子作為免疫調(diào)節(jié)過程中的重要成分參與PBC的發(fā)病，以下主要介紹促炎細(xì)胞因子IL-12、IL-17、IL-9、IL-8、TNFα、IL-6和抗炎細(xì)胞因子IL-10及其相關(guān)信號通路在PBC中的作用。

圖1PBC的發(fā)病機制

1.1 IL-12 IL-12家族包括IL-12、IL-23、IL-27、IL-35，是一組異二聚體分子，發(fā)揮多向免疫調(diào)節(jié)功能。IL-12主要由抗原遞呈細(xì)胞產(chǎn)生，由P35(IL-12A基因編碼)和P40(IL-12B基因編碼)亞基組成，分別與IL-12受體(IL-12 receptor，IL-12R)β2(IL-12RB2基因編碼)和IL-12Rβ1(IL-12RB1基因編碼)結(jié)合。IL-12通過IL-12—Janus激酶2(JAK2)—信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子4(STAT4)信號通路促進CD4+T淋巴細(xì)胞向Th1分化，Th1產(chǎn)生IFNγ和TNFα發(fā)揮促炎作用，同時IFNγ可能通過正反饋上調(diào)IL-12 Rβ2的表達(dá)，并抑制CD4+T淋巴細(xì)胞向Th17分化[5]。遺傳因素可能是PBC的發(fā)病基礎(chǔ)，研究[6]發(fā)現(xiàn)了27個與PBC相關(guān)的非人類白細(xì)胞抗原風(fēng)險基因位點，其中IL-12A和IL-12RB2基因位點與PBC的相關(guān)性最強，也最容易重復(fù)，且與IL-12通路有關(guān)的下游基因位點酪氨酸激酶2(tyrosine kinase 2，TYK2)、STAT4和與IL-12產(chǎn)生有關(guān)的上游基因位點干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor，IRF)5、細(xì)胞因子信號抑制物1(suppressors of cytokine signaling 1，SOCS1)、核因子-κB1(NF-κB1)和腫瘤壞死因子受體超家族成員1A(tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A，TNFRSF1A)均與PBC具有相關(guān)性。如IRF5與NF-κB結(jié)合促進包括IL-12在內(nèi)的Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，IRF8基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子與IL-12的啟動子結(jié)合也可以調(diào)節(jié)IL-12和IFNγ的產(chǎn)生[6]。IL-12—JAK2—STAT4通路相關(guān)分子的遺傳易感性與PBC密切相關(guān)。Yoshida等[7]發(fā)現(xiàn)，IL-12P40亞基在TGFβⅡ型受體顯性失活(dominant-negative transforming growth factor-β receptor type Ⅱ，dnTGFβRⅡ) 小鼠(PBC動物模型)中起致病作用，且在敲除IL-12P40亞基后血清細(xì)胞因子、肝臟門靜脈淋巴細(xì)胞浸潤、膽管損傷降低，膽管炎的癥狀得到改善，但是IL-12的靶向治療并未真正應(yīng)用于臨床。

1.2 IL-17 IL-17參與多種自身免疫性疾病的發(fā)展，然而在PBC中的作用尚不清楚。研究[8-10]發(fā)現(xiàn)，PBC患者及動物模型IL-2受體α敲除(IL-2 receptor α knockout mice,IL-2RαKO)小鼠、2-辛炔酸偶聯(lián)牛血清白蛋白(2-octynoic acid coupled to bovine serum albumin,2OA-BSA)小鼠外周血IL-17及肝組織中Th17高表達(dá)，肝組織中Th17主要聚集在受損的小葉間膽管周圍，而且2OA-BSA小鼠敲除IL-17后可減輕膽管損傷和降低AMA滴度，提示IL-17可能參與PBC的致病過程。國內(nèi)外學(xué)者[8,11]發(fā)現(xiàn)，Th17是由CD4+CD161+T淋巴細(xì)胞分化而來，同時肝臟的非實質(zhì)細(xì)胞(nonparenchymal cell，NPC)如肝巨噬細(xì)胞、肝竇狀內(nèi)皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞對Th17的生成具有重要意義。Lan等[8]研究表明，和單獨培養(yǎng)的脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞相比，與野生型小鼠肝臟NPC共培養(yǎng)的脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞可使IL-17的濃度增加約10倍。血清IL-6、IL-1β和IL-23可能誘導(dǎo)IL-17的生成，而血清IL-2對IL-17的生成起抑制作用[8,12]。因此，進一步研究IL-17參與PBC的具體機制時，需要考慮肝臟NPC與CD4+T淋巴細(xì)胞的相互作用及細(xì)胞因子環(huán)境。另外，外周血IL-17與肝組織Th17的分布不是一成不變的，隨著PBC疾病進展，IL-17在循環(huán)中逐漸減少，Th17在肝臟中逐漸積聚，且Th17可能以時間和劑量依賴方式促進肝星狀細(xì)胞增殖和IL-8分泌發(fā)揮促肝纖維化作用[11]。近年來，Kawata等[10]和Yang等[13]先后發(fā)現(xiàn)，IL-12/Th1和IL-23/Th17信號通路在PBC中起致病作用，IL-12/Th1在疾病早期起關(guān)鍵作用，IL-23/Th17可增強IL-12/Th1介導(dǎo)的免疫損傷，晚期PBC患者Th1/Th17平衡向Th17偏斜，提示Th17在PBC晚期起主導(dǎo)作用，推測Th17的失衡可能成為PBC晚期患者免疫治療的靶點。

1.3 IL-9 IL-9是由一種新發(fā)現(xiàn)的T淋巴細(xì)胞亞群即Th9分泌。 IL-9與其受體結(jié)合后發(fā)揮多效性，可能通過激活STAT3促進CD4+T淋巴細(xì)胞向Th17分化發(fā)揮促炎作用，也可能通過激活STAT5增強Treg的免疫抑制功能[14]。我國學(xué)者[15-17]初步發(fā)現(xiàn)，PBC患者外周血和肝組織中IL-9呈高表達(dá)，肝組織中增高的Th9主要位于門靜脈匯管區(qū)的BEC，與PBC主要損傷BEC一致；研究還發(fā)現(xiàn)，血清IL-9與IgG呈正相關(guān)，推測IL-9可能參與B淋巴細(xì)胞的分化增殖過程，促進自身抗體的產(chǎn)生，進而參與肝組織的炎癥損傷過程。肝纖維化是PBC等慢性肝病進展至終末期肝病的必經(jīng)階段，Qin等[18]首次發(fā)現(xiàn)IL-9具有促肝纖維化作用，Guo等[19]進一步發(fā)現(xiàn)IL-9主要通過Raf/MEK/ERK信號通路促進肝纖維化。目前，IL-9在PBC中的作用處于初步研究階段，尚需研究證實IL-9參與PBC的具體機制。

1.4 IL-8 IL-8作為一種趨化因子可以吸引中性粒細(xì)胞。研究[20]指出，膽汁淤積性肝病患者反應(yīng)性膽管周圍的中性粒細(xì)胞浸潤可能與受損BEC表達(dá)的IL-8有關(guān)。Yokoyama等[21]進一步證實，包括PBC在內(nèi)的慢性炎性膽管病變，肝內(nèi)BEC中IL-8的分泌是通過脂多糖(LPS)—Toll樣受體4(TLR4)—NF-κB—絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑。此外，IL-8與細(xì)胞生長、腫瘤發(fā)生相關(guān)，可以誘導(dǎo)膽管細(xì)胞增殖，有助于膽管損傷修復(fù)，但I(xiàn)L-8持續(xù)升高可能導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，進而發(fā)生癌癥。研究[22]發(fā)現(xiàn)，血清IL-8與原發(fā)性肝癌的腫瘤大小和分期顯著相關(guān)，同時PBC患者原發(fā)性肝癌的發(fā)生率較健康人明顯增高[23]，提示IL-8可能與PBC有關(guān)。Zimmermann等[24]通過對病毒、酒精、免疫及其他原因引起的200例慢性肝病患者血清IL-8進行檢測，發(fā)現(xiàn)PBC患者血清IL-8水平最高，且與肝纖維化進展密切相關(guān)；研究還發(fā)現(xiàn)，PBC患者肝內(nèi)IL-8及趨化因子受體1(chemokine receptor 1，CXCR1)明顯高表達(dá)，而且IL-8與肝內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤有關(guān)，與Isse等[20]研究結(jié)果一致。我國學(xué)者[25]也發(fā)現(xiàn)PBC患者血清IL-8升高，且與CXCR1呈正相關(guān)。最近一項研究[26]精確計算出血清IL-8每增加1 pg/ml，自身免疫性肝病患病概率增加48.36倍。雖然PBC患者對熊去氧膽酸(UDCA)的生化反應(yīng)可以評估其預(yù)后，但在治療前，幾乎無血清學(xué)標(biāo)志物能預(yù)測疾病轉(zhuǎn)歸。Umemura等[27]納入136例PBC患者，在UDCA治療前檢測33種血清學(xué)標(biāo)志物的表達(dá)水平，進行平均8.8年的隨訪，發(fā)現(xiàn)UDCA治療前，血清IL-8與肝失代償、肝病相關(guān)死亡有關(guān)。

1.5 TNFα TNFα主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，與受體結(jié)合后作用于肝細(xì)胞和BEC，激活細(xì)胞內(nèi)caspase通路和NF-κB途徑發(fā)揮促凋亡及調(diào)節(jié)作用。早期研究[28]發(fā)現(xiàn)，PBC患者血清TNFα增高與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，使用UDCA后TNFα降低。近年來，有學(xué)者[29]利用病理學(xué)二分法發(fā)現(xiàn)dnTGFβRⅡ小鼠敲除IL-6基因后結(jié)腸炎癥狀改善，而PBC癥狀加重，推測IL-6缺乏后會使肝臟TNFα代償性增加，因此使膽管炎癥狀加重。同時醫(yī)務(wù)工作者在使用生物制劑時，要充分考慮對其他自身免疫性疾病的副作用。TNFα可能在PBC中起顯著致病作用，TNFα拮抗劑或許對PBC的治療有效。Spadaro等[30]報道了1例46歲女性患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎合并PBC，患者對依那西普反應(yīng)良好，經(jīng)過30個月的隨訪，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及PBC均未再復(fù)發(fā)。隨后，Triantafillidis等[31]及Del Ross等[32]各報道了1例PBC合并其他自身免疫性疾病的患者，經(jīng)過阿達(dá)木單抗治療，同樣癥狀均得到改善。這些表明PBC與其他自身免疫性疾病可能有共同致病途徑，TNFα拮抗劑可能用于PBC的治療。

1.6 IL-6 已有研究[8-10]發(fā)現(xiàn)包括IL-6在內(nèi)的促炎細(xì)胞因子在PBC患者及動物模型血清中明顯升高。膽管細(xì)胞增生是膽汁性肝硬化發(fā)生的原因之一，研究[33]表明，LPS可能通過IL-6/STAT3途徑促進大鼠膽管細(xì)胞增生進而引發(fā)膽汁性肝硬化。2014年Saito等[34]報道了1例57歲女性，患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化癥合并淋巴結(jié)病、PBC，經(jīng)過9個月的托珠單抗治療，上述癥狀均改善。然而這只是個例，IL-6拮抗劑用于PBC的治療尚需要進一步研究。

1.7 IL-10 IL-10的主要來源是單核巨噬細(xì)胞和Th，IL-10與其受體結(jié)合后通過抑制主要組織相容性復(fù)合物及共刺激CD80和CD86的表達(dá)，進而抑制單核巨噬細(xì)胞向T淋巴細(xì)胞遞呈抗原的能力而發(fā)揮抑炎作用。近年來，在自身免疫性肝病中，與IL-10產(chǎn)生相關(guān)的Treg(CD4+CD25+FoxP3+)研究較為廣泛。Treg通過與細(xì)胞直接接觸或間接產(chǎn)生抑炎細(xì)胞因子如IL-10、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4，CTLA-4)等抑制過度免疫反應(yīng)。研究[35]發(fā)現(xiàn)，PBC患者Treg的數(shù)量及IL-10的產(chǎn)生均顯著低于健康人，但循環(huán)和肝臟的共刺激CD86顯著增加，表明PBC患者Treg抑制共刺激CD86表達(dá)能力的下降可能促進膽管損傷和肝纖維化；同時發(fā)現(xiàn)，Treg不僅數(shù)量減少，功能也會相對受損，使IL-10的產(chǎn)生進一步減少，推測可能與Treg對IL-2刺激的反應(yīng)性差有關(guān)。最近，一項研究[36]指出，PBC患者Treg對IL-12刺激的敏感度增加，產(chǎn)生更多IFNγ，可能與Treg內(nèi)STAT4快速而強烈的磷酸化有關(guān)，也提示PBC患者Treg功能受損。有學(xué)者[37]通過研究Foxp3+Treg敲除的Scurfy小鼠，發(fā)現(xiàn)Scurfy小鼠血清TNFα、IL-6、IL-12及AMA滴度顯著升高，門靜脈周圍也有中至重度淋巴細(xì)胞浸潤，與PBC表現(xiàn)相一致。此外，Tanaka等[38]在dnTGFβRⅡ小鼠的基礎(chǔ)上過繼轉(zhuǎn)移Foxp3+Treg后發(fā)現(xiàn)，膽管炎的癥狀較未過繼轉(zhuǎn)移小鼠明顯緩解。由此可見，IL-10及Treg對PBC可能是一種保護因素，通過抑炎作用維持自身免疫耐受，避免過度免疫反應(yīng)損傷機體。

2 細(xì)胞因子相關(guān)免疫治療在PBC中的進展

UDCA是治療PBC的一線用藥，但有約40%患者對UDCA應(yīng)答不佳，因此亟需尋找有效的替代療法。2016年，一種新型藥物奧貝膽酸(OCA)被批準(zhǔn)用于UDCA治療1年后應(yīng)答欠佳的患者，然而OCA在失代償期肝硬化中的作用尚不明確[39]。亦有將免疫抑制藥物嘗試用于PBC的研究，但療效較差，因此，研發(fā)新的、有效的藥物十分重要。與免疫抑制劑相比，生物療法的特異性更強。針對細(xì)胞因子及其信號通路在PBC中的作用，生物制劑的研發(fā)仍是一個新的領(lǐng)域。

2.1 IL-12信號通路拮抗劑 (1)抗IL-12/優(yōu)特克單抗(ustekinumab)：ustekinumab是一種靶向IL-12和IL-23共同亞基P40的單克隆抗體，已被批準(zhǔn)用于克羅恩病和銀屑病。國外一項Ⅱ期臨床試驗納入20例對UDCA應(yīng)答不佳的PBC患者，給予ustekinumab治療28周后，雖然血清ALP下降約12%，但無患者達(dá)到血清ALP下降≥40%的試驗預(yù)期終點(NCT 01389973)[40]。(2)JAK1/JAK2抑制劑/巴瑞克替尼(baricitinib)：IL-12可能通過IL-12—JAK2—STAT4信號通路在PBC中發(fā)揮促炎作用[5]。baricitinib是JAK1/JAK2的抑制劑，已被批準(zhǔn)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，關(guān)于baricitinib在PBC中的療效觀察正在進行Ⅱ期臨床試驗(NCT03742973)。

2.2 IL-17信號通路拮抗劑 IL-17的靶向治療已在多種自身免疫性疾病中取得令人滿意的療效，如中和IL-17A的蘇金單抗(secukinumab)、依奇珠單抗(ixekizumab)和中和IL-17受體A的布羅達(dá)單抗(brodalumab)，在銀屑病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎等 Ⅱ/Ⅲ 期臨床試驗中的結(jié)果均較好[12]。以銀屑病為例，Ⅱ期臨床試驗發(fā)現(xiàn)銀屑病患者使用secukinumab(NCT01071252)、ixekizumab(NCT01107457)、brodalumab(NCT00975637)12周后，大多數(shù)患者的銀屑病面積和嚴(yán)重性指數(shù)較基線水平至少改善75%， Ⅲ期臨床試驗(NCT01365455)進一步發(fā)現(xiàn)secukinumab比依那西普對銀屑病的療效更快、更持久[12]。netakimab(BCD-085)作為中和IL-17A的另一單克隆抗體，已被批準(zhǔn)用于銀屑病，其在PBC中的療效觀察也正在進行臨床試驗。

2.3 Treg細(xì)胞療法 Treg及IL-10、CTLA-4維持機體內(nèi)免疫耐受狀態(tài)，可能用于自身免疫性疾病和實體器官移植術(shù)后的治療。(1)Treg：2016年一項研究[41]納入10例活體肝移植患者，過繼轉(zhuǎn)移Treg，同時原有免疫抑制劑逐漸減量，發(fā)現(xiàn)7例患者可完全停用免疫抑制劑，其余3例患者在免疫抑制劑減量期間出現(xiàn)輕度排斥反應(yīng)，而這3例患者均是自身免疫性肝病患者。因此，Treg用于維持自身免疫性肝病患者的免疫耐受狀態(tài)，尚需進一步研究證實。目前正在進行一系列臨床試驗，如Treg在肝移植術(shù)后(NCT02188719、NCT02474199、NCT02166177)、腎移植術(shù)后(NCT02091232、NCT02129881、NCT02088931、NCT02711826)及系統(tǒng)性紅斑狼瘡(NCT02428309)中的安全性及療效觀察。(2)CTLA-4/阿巴西普(abatacept)：Treg分泌CTLA-4，與抗原遞呈細(xì)胞上的共刺激CD80/CD86結(jié)合，抑制T淋巴細(xì)胞活化。Popp等[42]報道了1例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎合并PBC的51歲女性患者，給予abatacept后癥狀改善。隨后，一項Ⅲ期臨床試驗，納入16例對UDCA應(yīng)答欠佳的PBC患者，給予abatacept治療24周后，僅有1例達(dá)到試驗預(yù)期終點(NCT02078882)[43]。(3)IL-10生物制劑：關(guān)于IL-10的生物制劑，目前僅用于科研實驗，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途。

2.4 其他 IL-8、IL-9拮抗劑在PBC中的報道較少，僅有研究[44]發(fā)現(xiàn)，在右旋糖酐硫酸酯鈉誘導(dǎo)的炎癥性腸病小鼠模型中，靶向IL-8受體的SB225002拮抗劑可降低炎癥性腸病的嚴(yán)重程度。TNFα拮抗劑依那西普[30]、阿達(dá)木單抗[31-32]及IL-6拮抗劑托珠單抗[34]可以緩解PBC的癥狀僅屬于個例，可能與PBC和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、克羅恩病等其他自身免疫性疾病有共同致病途徑相關(guān)。

3 小結(jié)與展望

綜上所述，PBC是一種慢性自身免疫性肝病，免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子在固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答過程中參與PBC的發(fā)生發(fā)展。本文著重討論了促炎細(xì)胞因子IL-12、IL-17、IL-9、IL-8、TNFα、IL-6和抗炎細(xì)胞因子IL-10及其信號通路在PBC中的作用。隨著PBC疾病進展，不同疾病階段發(fā)生的免疫反應(yīng)及致病信號通路不同，細(xì)胞因子的表達(dá)水平也不同。此外，細(xì)胞因子之間及其與免疫細(xì)胞之間相互作用，各種自身免疫性疾病有部分相同的病理特征，使PBC的發(fā)病機制更為復(fù)雜，至今仍未完全闡明。UDCA是治療PBC的一線用藥，但仍有部分患者對其應(yīng)答不佳，新型藥物如OCA，應(yīng)用于對UDCA應(yīng)答不佳的患者，療效尚不確切。因此，研發(fā)新型、高效、高特異性的藥物十分重要。目前，細(xì)胞因子療法在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，而針對細(xì)胞因子的生物療法如baricitinib、netakimab、Treg細(xì)胞療法等在PBC中的研究及應(yīng)用仍處于試驗階段，值得進一步深入研究。期待針對細(xì)胞因子的生物療法早日成為臨床治療PBC的有效策略。