電針對肝葉切除術后大鼠認知功能及海馬膠質細胞的影響

劉佩蓉,張瑜,劉春亮,彭生

·動物實驗·

電針對肝葉切除術后大鼠認知功能及海馬膠質細胞的影響

劉佩蓉,張瑜,劉春亮,彭生

(上海中醫藥大學附屬第七人民醫院,上海 200137)

觀察電針刺激對手術應激誘導大鼠認知功能的影響,并通過觀察海馬神經膠質細胞激活對其機制進行初步探討。老年雄性SD大鼠72只,隨機分為3組,每組24只,對照組采用假手術(sham組,S組);模型組(model組,M組)通過肝左葉切除術誘導產生認知功能障礙;電針組(Electroacupuncture組,EA組)接受肝左葉切除術和術后每日1次,每次30 min的電針刺激。Morris水迷宮評估認知功能,酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測海馬膠質細胞源性神經營養因子(GDNF),免疫熒光檢測海馬小膠質細胞標記物CD68和星形膠質細胞GFAP的表達。與M組相比較,EA組大鼠術后1 d、3 d、7 d的逃避潛伏期縮短(＜0.05),跨越平臺次數增加(＜0.05)。與術前比較,M組和EA組大鼠術后海馬GDNF水平均顯著降低(＜0.05)。與M組相比較,復合電針調節后的EA組術后各時間點海馬組織GDNF表達水平顯著上調(＜0.05)。M組術后海馬組織CD68、GFAP表達顯著上調(＜0.05),復合電針調節后的EA組大鼠海馬組織CD68和GFAP的上調得到了顯著抑制(＜0.05)。電針可顯著改善術后認知功能障礙大鼠記憶功能,其機制可能與抑制小膠質細胞及星形膠質細胞的激活有關。

術后認知功能障礙;電針;肝葉切除術;小膠質細胞;星形膠質細胞;大鼠

術后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction, POCD)是老年患者常見的手術后并發癥,以記憶、注意力、語言等認知功能的明顯下降為臨床特征[1]。術后,約14%老年患者在3個月內發生認知能力下降[2]。POCD的病理機制復雜,至今尚未闡明。其中各種原因導致的神經細胞數量減少和過度凋亡在其中起到了重要作用。近年來發現不單是神經細胞,膠質細胞的過度激活在其中也起著重要作用,尤其是小膠質細胞和神經膠質細胞的激活對中樞炎癥的調節起著關鍵作用[3]。既往研究表明,特定穴位電針刺激可以抑制中樞神經系統膠質細胞活化。而電針刺激能否通過抑制小膠質細胞和星形膠質細胞的活化改善POCD,尚少見報道,因此本研究進行了觀察。

1 材料與方法

1.1 動物選擇和分組

清潔級老齡雄性Sprague Dawley大鼠(18月齡, 500～600 g)72只(斯萊克實驗動物中心,上海),采用隨機數字表法分為假手術組(Sham組,S組),對照用;模型組(model組,M組),采用肝左葉切除手術誘導POCD;電針組(Electroacupuncture, EA組),肝左葉切除＋電針調節大鼠,每組24只。本研究得到上海中醫藥大學附屬第七人民醫院倫理委員會批準。

1.2 POCD動物模型的建立

參照Tian Y等[4]POCD模型制作方法。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉,仰臥位固定,消毒后,在上腹部中線做一個小切口,行肝左葉切除,徹底止血后,逐層關腹。手術時間控制在大約90 min。待手術結束正常清醒后,采用Morris水迷宮測試,定位巡航時間比正常組＞10 s,90 s內空間探索次數比正常大鼠＜3次,即認為造模成功[5]。Sham組,麻醉后行上腹部中線皮膚切開縫合,不切除肝左葉。

1.3 干預方法

參照尚華杰等[6]固定和電針處理方法。EA組大鼠選擇百會及雙側內關穴、合谷穴,不銹鋼針(0.35 mm ×13 mm)垂直角度刺入約2.5 mm。然后,百會穴與韓氏穴位神經刺激儀(LH202H,北京)連接(與百會穴形成環路的另一電極,連接于百會穴后5 mm的非穴點),頻率2/10 Hz,強度4 mA,疏密波持續刺激。電針干預從術前30 min持續至手術結束。術后1～7 d,每天固定時間行電針刺激1次,每次30 min。對照組和模型組大鼠采取同樣的操作,抓取、固定相同的時間,但不予電針干預。

1.4 檢測指標

1.4.1 學習記憶功能

參照經典Morris水迷宮測試方法[7],定位巡航實驗測試學習能力,空間探索實驗測試記憶能力。術前所有大鼠均在Morris水迷宮中接受連續5 d,每天4次的訓練。定位巡航實驗,將透明平臺放置在水池4個象限中的一個(靠近中心的1/2個半徑內),平臺頂部低于水面1 cm。將大鼠置于離平臺最遠的象限,讓它們找到并爬上平臺,并將其記錄為逃避潛伏期。如果最終沒有找到平臺,逃避潛伏期記為60 s。空間探索實驗,取出平臺,將老鼠放在前一個測試的相反象限的水中。觀察每只老鼠的游泳路徑,記錄90 s內老鼠越過原平臺位置的次數(跨平臺次數)。

1.4.2 海馬膠質細胞損傷水平

在術后1 d、3 d、7 d進行測試,每次測試后每組8只大鼠斷頭取腦,分離海馬組織,冰浴下超聲波粉碎,制成勻漿,10000×離心10 min,取上清。ELISA法檢測GDNF蛋白表達水平(450 nm觀察,酶標儀ricso rk201,深圳ricso科技有限公司,Ltd,深圳)。

1.4.3 小膠質細胞和星形膠質細胞激活水平

采用CD68蛋白表達代表小膠質細胞激活水平,GFAP代表星形膠質細胞激活水平,免疫熒光法檢測。小鼠抗大鼠單克隆CD68抗體(AbD Serotec公司,英國),兔抗大鼠多克隆GFAP抗體(Abcam公司,英國)。所有免疫熒光圖像釆用Leica Application Suit Version3.7(LAS V3.7)釆集,分別在海馬CA1、CA3、DG區采集各指標免疫熒光圖像,每只大鼠隨機抽取5張切片,每張切片隨機抽取5個視野,釆用Image-Pro Plus圖像分析系統,以平均光密度值反映目的蛋白的表達水平,結果用均數±標準差表示。參照孫曉彩等[8]介紹的方法,對海馬CA1、CA3、DG區取材。大鼠斷頭取腦后置于冰盒上,快速取海馬,置于解剖顯微鏡下,去除周邊多余組織及血管,切除兩末端,將剩余海馬等份切為三段,垂直放置,找到海馬錐體線后,先切CA3區,在大彎端,將剩余部分沿錐體線一分為二,上端透明部分為CA1,下端深色為DG區。

1.5 統計學方法

采用SPSS19.0軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料采用均數±標準差表示,計數資料采用次和百分比表示。采用單因素重復測量方差分析()比較3組之間的差異及各組的兩兩之間的差異。以＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 電針顯著改善POCD大鼠學習記憶能力

Morris水迷宮實驗結果顯示,與假手術組(S組)相比較,肝葉切除術(M組)后大鼠1 d、3 d、7 d的逃避潛伏期均顯著延長(＜0.05)(見圖1),跨平臺次數顯著減少(＜0.05)(見圖2),提示手術導致了大鼠術后記憶功能顯著下降。當在特定穴位給予電針刺激后(EA組)大鼠1 d、3 d、7 d的逃避潛伏期雖然仍較假手術組延長,但較手術的模型組(M組)已經顯著縮短,跨越平臺次數顯著增加(＜0.05)(見圖1、表1、圖2、表2)。提示,特定穴位電刺激可以顯著抑制記憶能力的顯著下降。

圖1 術后7 d逃避潛伏期(s)

圖2 術后7 d單位時間內跨越平臺次數

表1 各組不同時間點逃避潛伏期比較 (±s,s)

注:與S組同時點比較1)＜0.05;與M組同時點比較2)＜0.05

表2 各組不同時間點跨越平臺次數比較 (±s,次)

注:與S組同時點比較1)＜0.05;與M組同時點比較2)＜0.05

2.2 電針顯著減輕POCD大鼠海馬膠質神經細胞的損傷

膠質源神經營養因子(GDNF)是一種多肽類的神經營養因子,對損傷的神經細胞有營養和保護作用。結果顯示,接受手術后(M組)大鼠GDNF含量顯著下降(＜0.05),而復合電針刺激的大鼠(EA組)GDNF表達較M組顯著回升(＜0.05)(見表3)。提示電針刺激能減輕手術誘導海馬膠質細胞的損傷。

表3 不同時間點海馬GDNF表達水平比較 (±s,ng/mL)

注:與S組同時點比較1)＜0.05;與M組同時點比較2)＜0.05

2.3 電針對海馬各區小膠質細胞CD68和星形細胞GFAP表達的影響

與S組比較,M組術后1 d、3 d、7 d小膠質細胞CD68的表達顯著上調;與M組比較,復合針刺的EA組顯著抑制了術后CD68的上調(＜0.05)。與S組比較,術后1 d、3 d、7 d左肝葉切除的M組星形膠質細胞GFAP表達顯著上調,復合針刺干預的EA組則顯著抑制了GFAP的上調(＜0.05)。詳見表4、表5。

術后1 d、3 d時小膠質細胞以胞體相對較小,突起喙突,偽足伸出,阿米巴樣改變的活化狀態為主(紅色);星形膠質細胞主要發生了胞體變大,側枝變多的改變(綠色)。在7 d時小膠質細胞多回復至胞體相對較大、形狀不規則、有細長分支狀突起的靜息狀態;星形膠質細胞胞體變小,側枝減少。詳見圖3。

表4 各組術后小膠質細胞CD68表達的比較 (±s)

注:與S組同時點比較1)＜0.05;與M組同時點比較2)＜0.05

表5 各組術后星型膠質細胞GFAP表達的比較 (±s)

注:與S組同時點比較1)＜0.05;與M組同時點比較2)＜0.05

圖3 EA組術后1 d、3 d、7 d海馬組織CD68和GFAP表達的免疫熒光圖

3 討論

術后認知功能障礙是手術后常見的并發癥,表現為術后的學習記憶能力下降及失眠、焦慮、人格障礙等,嚴重的可出現抑郁及自殺傾向。尤其是老年患者,術后發生率顯著增加。雖然近年來進行了大量的研究,但由于其機制不清,臨床尚無明確有效的防治措施[9-10]。

本研究中選擇了18月齡大鼠模擬老年機體進行研究,根據文獻[6]選擇了肝左葉切除術建立POCD模型。行為學研究采用了經典的Morris水迷宮實驗[11],手術前連續5 d對其進行了訓練,保證每只大鼠都能在90 s內找到水下平臺。結果發現,手術后大鼠記憶能力出現了顯著下降,實驗中表現為找到水下平臺時間顯著增加,同時在定位巡航實驗中單位時間內游過原水下平臺的次數顯著減少。而給予電針刺激的手術后大鼠,其記憶能力雖然仍較假手術組差,但是比沒有給予電針刺激的大鼠已經顯著得到改善,提示電針特定穴位刺激可以改善手術刺激導致的記憶障礙。

針灸治療癡呆歷史源遠流長,早在晉代皇甫謐的《針灸甲乙經》中就有相關記載。針刺可通過刺激人體特定腧穴,起到疏通經絡、調節神志、益智健腦等作用,在改善腦組織代謝、保護神經元細胞以增強認知功能等方面有確切療效。電針療法將大部分刺激進行量化,可通過改變波形、頻率和刺激強度以達到更好的治療效應[12]。近年來涌現出大量將電針用于防治認知功能障礙的臨床和基礎研究,如錢立鋒等[13]發現電針刺激百會穴顯著改善患者卒中后認知功能障礙。薛洋等[14]發現電針百會穴聯合神庭穴對卒中后認知障礙治療效果更好。這些結果均提示電針刺激是有潛在應用價值的治療方法,因此選擇了動物實驗進行進一步的研究,并對其機制進行了初步探究。前期研究發現改善大鼠POCD與調節海馬a7-煙堿型乙酰膽堿受體(a7- nAChR)的表達抑制海馬炎癥反應[15],減少海馬神經元細胞過度凋亡[16]及抑制腦源性神經細胞營養因子(BDNF)有關[17]。

前期研究多集中在對神經細胞,近年來發現其支持細胞——膠質細胞同樣起著重要作用[18-19],因此本研究對其進行了觀察。神經細胞分泌腦源性神經細胞營養因子(BDNF),同樣神經膠質細胞也分泌膠質細胞源性神經營養因子(GDNF),其對神經膠質細胞的存活起著重要作用[20-22]。記憶功能與海馬聯系緊密,尤其是CA1區神經元比較致密,起著重要作用,因此選擇了CA1區進行了觀察。結果顯示,手術后1～7 d均出現GDNF含量顯著下降,而復合了電針的EA組大鼠,CA1區GDNF含量的下降則得到了部分的抑制。提示海馬區GDNF的表達參與了電針誘導的POCD改善。GDNF表達的增加是否導致確實減輕了膠質細胞的損傷?因此,又進行了進一步對小膠質細胞和星形膠質細胞的活化狀態進行了研究。CD68和GFAP分別是兩者活化的標志性蛋白,膠質細胞活化后可以產生大量炎性細胞因子,而過度的炎癥反應也是導致POCD因素之一,因此選擇了對其進行檢測,可以反映兩種膠質細胞的存活量。通過免疫熒光觀察,所有大鼠術后1 d、3 d時海馬小膠質細胞以胞體相對較小,偽足伸出,阿米巴樣改變的活化狀態為主(紅色);星形膠質細胞主要發生了胞體變大,側枝變多的改變(綠色)。在7 d時小膠質細胞多回復至胞體相對較大、形狀不規則、有細長分支狀突起的靜息狀態;星形膠質細胞胞體變小,側枝減少。接受手術的M組大鼠CD68和GFAP的表達顯著增加,提示手術應激激活了海馬膠質細胞和小膠質細胞的表達。不只是手術,楊美華[22]發現麻醉應激同樣可以導致膠質細胞的激活,導致POCD的發生。而復合電針刺激后的EA組大鼠,其CD68和GFAP的增加得到了顯著抑制,提示電針刺激可以抑制小膠質細胞和星形膠質細胞的激活,進而可以通過減輕中樞神經系統炎癥反應,改善POCD。

認知功能涉及范圍較廣,本研究只觀察了學習和記憶,下一步有待對更多的指標進行觀察。膠質細胞中樞神經系統中包括星形膠質細胞、少突膠質細胞和小膠質細胞,本文只檢測了星形膠質細胞與小膠質細胞,還有少突膠質細胞沒有研究。認知功能還與大腦的皮質有關,海馬主要是與學習記憶關系緊密,對其他腦區的功能的影響也有待于進一步研究。

綜上所述,在本實驗條件下發現,電針刺激可顯著改善手術誘導POCD大鼠的認知功能,其機制與抑制海馬膠質細胞的激活有關。但詳細機制尚需進一步研究。

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Effect of Electroacupuncture on Cognitive Function and Hippocampal Glial Cells in Partially Hepatectomized Rats

-,,-,.

’,200137,

To investigate the effect of electroacupuncture on surgical stress-induced cognitive dysfunction in rats and preliminarily explore its mechanism of action by observing the activation of hippocampal glial cells.Seventy-two aged male rats were randomized to three groups: control, model and electroacupuncture, 24 rats each. The control (sham) group (S group)received a sham operation. The model group (M group) received left hepatic lobectomy, which induced cognitive dysfunction. The electroacupuncture group (EA group) received left hepatic lobectomy and postoperatively electroacupuncture 30 min once daily. Cognitive function was assessed using the Morris water maze. Hippocampal glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The expressions of hippocampal microglia marker CD68 and astrocyte GFAP were determined by immunofluorescence.Compared with the M group, the escape latency shortened and the number of crossing platform increased in the EA group at one, three and seven day after the surgery (＜0.05). Hippocampal GDNF levels increased significantly in the M and EA groups of rats after the surgery compared with before (＜0.05). Compared with the M group, the expression of hippocampal GDNF was significantly up-regulated in the EA group after composite electroacupuncture regulation at various time points after the surgery (＜0.05). Hippocampal CD68 and GFAP expressions were significantly up-regulated in the M group postoperatively (＜0.05). The up-regulation of hippocampal CD68 and GFAP was significantly inhibited in the EA group after composite electroacupuncture regulation (＜0.05).Electroacupuncture can markedly improve memory function in rats with postoperative cognitive dysfunction. Its mechanism of action may be related to the inhibition of microglia and astrocyte activation.

Postoperative cognitive dysfunction; Electroacupuncture; Hepatic lobectomy; Microglia; Astrocyte; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2020.02.0226

1005-0957(2020)02-0226-06

2019-05-20

上海市浦東新區衛生系統重要薄弱學科項目(PWZbr2017-19);上海市浦東新區衛生系統學科帶頭人培養計劃(PWRd2016-17,PWRd2016-19)

劉佩蓉(1976—),女,副主任醫師,碩士,Email:lpeir@126com

彭生(1977—),男,副主任醫師,博士,Email:ps7707@163.com