福建牡蠣17β-HSD基因的克隆及其生殖周期表達

曾 臻，倪健斌，譚強來，史 博，余美舜，李偉杰，蔡 廣

(1.廈門醫(yī)學院海洋生物醫(yī)藥資源福建省高校工程研究中心，福建 廈門 361023；2.廈門醫(yī)學院天然化妝品福建省高校工程研究中心，福建 廈門 361023；3.廈門大學近海海洋環(huán)境科學國家重點實驗室，福建 廈門 361102；4.集美大學水產(chǎn)學院，福建 廈門 361023)

福建牡蠣(Crassostreaangulata)是福建沿海最重要的養(yǎng)殖貝類，其養(yǎng)殖產(chǎn)量居于貝類養(yǎng)殖中的第一位，對生殖調(diào)控的研究在福建牡蠣養(yǎng)殖中具有重要的意義[1]。現(xiàn)代內(nèi)分泌學認為激素是細胞與細胞之間傳遞信息的化學信號物質(zhì)，其中性腺激素是參與貝類生殖活動的重要激素。然而目前國內(nèi)外有關(guān)貝類生殖內(nèi)分泌的研究卻十分有限。

類固醇激素是最主要的一類性腺激素，包括雄激素、雌激素和孕酮等。目前有關(guān)貝類中類固醇激素合成和代謝機制的研究較少，而且比較零散。研究發(fā)現(xiàn)，貝類中類固醇激素合成的底物與脊椎動物同樣是膽固醇和孕烯醇酮[2-3]。這些性類固醇激素參與了貝類的生殖調(diào)控，在貝類的性腺發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。然而，關(guān)于類固醇激素在貝類中是如何發(fā)揮作用的還不甚清楚。

17β-羥基類固醇脫氫酶(17β-Hydroxysteroid dehydrogenase，17β-HSD)作用在類固醇激素合成的最后一步及之后代謝過程的起始階段，它能夠還原17-酮類固醇或者氧化17β-羥基類固醇，可以催化雄烯二醇和睪酮、雌酮和雌二醇、雄烯二酮和二氫睪酮之間的相互轉(zhuǎn)化。對于脊椎動物來說，只有17β-羥基化的雄激素和雌激素才具有生物活性，而17β-酮基化的則沒有[4]。之前的研究結(jié)果表明，在貽貝、牡蠣、蛤等貝類性腺和消化腺組織中能夠檢測到17β-HSD的活性，它具有跟脊椎動物17β-HSD類似的生物學功能[5]；Matsumoto等(1997)還發(fā)現(xiàn)扇貝(Placopectenmagellanicus)體內(nèi)17β-HSD的活性在生殖周期的不同時段呈現(xiàn)規(guī)律性變化，即隨著性腺的發(fā)育逐漸升高，而在排卵后又明顯降低，這說明其可能參與了扇貝性腺發(fā)育的調(diào)控過程[5]。

本研究擬通過對福建牡蠣類固醇激素合成相關(guān)酶的基因17β-HSD進行結(jié)構(gòu)和功能探究，結(jié)合其時空表達特征及在性腺細胞中的定位，為闡明牡蠣類固醇激素的合成機制奠定基礎(chǔ)，為進一步研究牡蠣生殖內(nèi)分泌機理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗用福建牡蠣購自福建省漳州市斗美村漁排，總重為3.8～14.0 g。根據(jù)形態(tài)學觀察[6]，將所采樣品分為增殖期、生長期、繁殖期和排放期4個階段，選取每個時期15只雄性和15只雌性作為本研究的實驗對象。取每個時期牡蠣不同組織(性腺、閉殼肌、外套膜、鰓、內(nèi)臟團)放入液氮中速凍后保存于-80 ℃冰箱中備用，同時取一小塊成熟期性腺組織固定于4%多聚甲醛溶液中。

1.2 RNA提取

按照試劑使用說明書，將樣品置于Trizol?Reagent(Invitrogen, USA)分別勻漿，分別提取不同組織總RNA，通過Nanodrop ND-2000分光光度計檢測RNA的濃度和純度，結(jié)合1%的變性瓊脂糖凝膠上電泳檢測其完整性。

1.3 17β-HSD 基因cDNA全長序列的克隆

將所得的RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TIANGEN，China)步驟分別進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。按照Full-RACE Core Set Ver.2.0 試劑盒(TAKARA, China)要求，根據(jù)本實驗室構(gòu)建的福建牡蠣轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選獲得的17β-HSD基因的序列片段，分別設(shè)計并合成5′和3′ RACE特異性引物(表1)，對17β-HSD基因進行5′和3′ RACE擴增，并送廣州英韋創(chuàng)津(Invitrogen)生物技術(shù)公司進行測序分析。

表1 實驗所用引物序列

1.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

根據(jù)QuantacDNA 第一鏈合成試劑盒(TIANGEN, China)的說明書合成cDNA 第一條鏈。以cDNA第一條鏈為模板，以牡蠣Elongationfactor1α基因(EF1α, GenBank accession no.BQ426516)作為內(nèi)參基因[6]，運用SYBR GreenⅠ染料法在ABI 7500 fast system real-time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems, USA)上定量分析不同時期牡蠣17β-HSD基因的mRNA表達變化。每個實驗組設(shè)置5個平行樣，每個樣品設(shè)置3個重復孔。每輪反應均設(shè)有cDNA實驗組、陰性對照組。本實驗所使用的試劑盒為SYBR Green qPCR Kit(Thermo,USA)，反應條件如下：預變性95 ℃ 10 min; 95 ℃ 20 s, 52 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s, 35個循環(huán)。反應結(jié)束后對每個基因的熔解曲線進行分析。

所得數(shù)據(jù)用ABI 7500 system SDS 軟件(version 1.4, Applied Biosystems)進行分析，用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量[7-8]。

1.5 原位雜交

基于所獲的17β-HSD基因序列，設(shè)計雜交探針的引物(表1)，參考Ni等(2013)的方法對固定于4%多聚甲醛溶液中(4 ℃固定過夜)的性腺組織進行原位雜交[9]。

1.6 目的基因的生物信息學分析

用BLAST軟件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行序列同源性比對；用DNAMAN軟件進行比對拼接，得到基因的全長序列；用Compute pI/Mw tool(http://web.expasy.org/protparam/)預測等電點和分子量；用SignalP 3.0 軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)尋找信號肽；用TMHMM軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)預測蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域；用Predict Protein 軟件(http://www.predictprotein.org/)預測蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域；用CLUSTALX軟件進行多重序列比對；用MEGA 4.0軟件中的鄰接法(1 000 bootstrap replicates)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與討論

2.1 福建牡蠣17β-HSD基因的序列全長及特征

如圖1，福建牡蠣17β-HSD基因(ca17β-HSD)cDNA全長1 149 bp，包括45 bp的5′-UTR(5′-Untranslated Region)，183 bp的3′-UTR和921 bp的ORF(Open Reading Frame)。序列3′-UTR中存在典型的poly A加尾信號AATAAA。ca17β-HSD基因可編碼307個氨基酸，預測蛋白分子量為34.084 kDa，等電點為8.58。SignalP和TMHMM軟件預測ca17β-HSD氨基酸序列具有1個跨膜結(jié)構(gòu)和1個信號肽，分別位于AA10—AA32和AA1—AA20。第AA44—AA283為ca17β-HSD氨基酸序列保守的氧化還原酶功能結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包括1個酶活性中心YSSSK(AA191—AA195)、1個輔酶結(jié)合位點TG***G*G(AA48—AA55)和1個結(jié)構(gòu)性保守序列NNAG(AA125—AA128)。

圖1 福建牡蠣17β-HSD基因的核酸序列和氨基酸序列

2.2 福建牡蠣17β-HSD基因的同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)過序列多重比對發(fā)現(xiàn)，ca17β-HSD氨基酸序列屬于17β-HSD11亞型，它與太平洋牡蠣(Crassostreagigas)和雜色鮑(Haliotisdiversicolor)17β-HSD11亞型的氨基酸序列相似性分別為99%和57%，與脊索動物17β-HSD11亞型的氨基酸序列相似性為45%，與其他脊椎動物17β-HSD11亞型的氨基酸序列相似性為40%～44%(圖2)。通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，我們發(fā)現(xiàn)所選取的不同物種的17β-HSD氨基酸序列可以分為三個亞型，分別是17β-HSD11亞型、17β-HSD12亞型和17β-HSD4亞型，其中17β-HSD11亞型和17β-HSD12亞型親緣性更高。在17β-HSD11亞型中，ca17β-HSD11先與太平洋牡蠣17β-HSD11聚為一枝，再與同為貝類的雜色鮑17β-HSD11聚類，接著再依次與脊索動物和其他脊椎動物聚類(圖3)。

圖2 福建牡蠣及其他物種17β-HSD氨基酸序列的多重比對

圖2、3中各物種17β-HSD氨基酸序列在NCBI上的登錄號如下：太平洋牡蠣(Crassostreagigas)11, EKC30097.1; 雜色鮑(Haliotisdiversicolor)11, ADV02385.1; 柱頭蟲(Saccoglossuskowalevskii)11, XP_002732320.1;非洲爪蟾(Xenopustropicalis)11, NP_001011240.1; 原鴿(Columbalivia)11, EMC85029; 家鼠(Musmusculus)11, NM_053262.3; 牦牛(Bosgrunniensmutus)12, ELR49992; 鴨嘴獸(Ornithorhynchusanatinus)12, XP_001509870; 紅原雞(Gallusgallus)12, XP_426310.2; 斑馬魚(Daniorerio)12, NM_200881; 雜色鮑(Haliotisdiversicolor)12, ADF80270.1; 狗巖螺(Nucellalapillus)12, JX625140.1; 馬(Equuscaballus)12, XP_001488432; 綿羊(Ovisaries)12, XP_004016470; 柱頭蟲(Saccoglossuskowalevskii)12, XP_002733503; 智人(Homosapiens)12, NP_057226.1; 野豬(Susscrofa)12, BAI47714; 紫海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)12, XP_798337; 斑馬魚(Daniorerio)4, AAK27967; 河鱒(Salmotruttafario)4, ACN66287; 櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)4, AGC26171; 底鳉(Fundulusheteroclitus)4, BAF74749; 家鼠(Musmusculus)4,CAA62015。

2.3 福建牡蠣17β-HSD基因在不同組織中的表達

如圖4所示，在福建牡蠣性腺、外套膜、鰓、閉殼肌和內(nèi)臟團等組織中均能檢測到17β-HSD基因的表達，其中性腺的表達量最高(p<0.05)，其次為內(nèi)臟團，而17β-HSD基因在鰓、外套膜、閉殼肌中的表達量差異不顯著(p>0.05)。

2.4 福建牡蠣17β-HSD基因在生殖周期中的表達模式

圖5反映了當性腺開始發(fā)育后，福建牡蠣性腺中17β-HSD基因的表達量開始下降(p<0.05)，在性腺發(fā)育的生長期和成熟期，其表達量均維持在一個較低的水平。而在配子排放后，性腺中17β-HSD基因的表達量反而急劇升高，達到成熟期表達量的3倍之多(p<0.05)。

圖3 17β-HSD在福建牡蠣和其他物種間的進化分析

圖4 17β-HSD基因在福建牡蠣各組織中的表達

圖5 17β-HSD基因在福建牡蠣性腺不同發(fā)育階段的表達

圖6 福建牡蠣17β-HSD基因在成熟卵巢中的分布

2.5 福建牡蠣17β-HSD基因在卵巢中的細胞定位

結(jié)果顯示17β-HSD基因在福建牡蠣卵巢中呈現(xiàn)出細胞定位。能與DIG標記的17β-HSD基因的反義RNA探針雜交，顯色后呈藍黑顏色的陽性信號主要分布在卵細胞周邊的個體小的濾泡細胞上，而在成熟卵細胞上沒有發(fā)現(xiàn)有陽性信號(圖6)，這說明17β-HSD基因均主要表達在福建牡蠣卵巢組織的濾泡細胞中。

2.6 討論

17β-HSD是性類固醇激素合成過程最后步驟中的催化酶，它以NADH/NADPH為輔基，通過催化性類固醇激素C17位上的醇基和酮基之間的氧化還原反應，使低生物活性的雌酮、雄烯二酮與高生物活性的雌二醇、睪酮之間進行相互轉(zhuǎn)化[4]。脊椎動物17β-HSDs大都數(shù)均屬于短鏈脫氫酶/還原酶(SDR)超家族，其中2、4、6、8、9、10、11、14亞型為氧化酶，1、3、5、7、12亞型是還原酶。已有的研究表明，貽貝、牡蠣、蛤等貝類性腺和消化腺中均存在17β-HSD的活性，它們具有跟脊椎動物中17β-HSD類似的生物學功能[5,10-12]。Matsumoto等(1997)還發(fā)現(xiàn)扇貝體內(nèi)17β-HSD的活性變化與生殖過程顯著相關(guān)，生長期性腺中17β-HSD的活性約是排卵后的2倍[5]。此外，目前已有研究者成功獲得了狗巖螺(Nucellalapillus)[13]、雜色鮑[14-15]和櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[16]的17β-HSD基因序列全長，并研究了其在不同性別及性腺發(fā)育不同階段的表達模式，結(jié)果表明17β-HSD在貝類的性腺發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。其中有研究者通過基因克隆和瞬時轉(zhuǎn)染的方法在雜色鮑中鑒定到兩種有活性的17β-HSD亞型，其中一種是17β-HSD12，它是一種還原酶，能將雌酮轉(zhuǎn)化為雌二醇，增加雌激素的活性，雜色鮑生殖周期中，17β-HSD12的表達量隨著性腺的發(fā)育逐步升高，催化了雌酮向雌二醇的轉(zhuǎn)化，從而提高了雌二醇的水平，有助于性腺的發(fā)育[14]；另一種亞型是17β-HSD11，它是一種氧化酶，能將睪酮氧化為雄烯二酮，可以降低雄激素的活性[15]。本實驗用RACE的方法首次獲得了福建牡蠣17β-HSD基因的cDNA全長序列，它們具有17β-HSDs家族基因保守的結(jié)構(gòu)特征，如Rossman折疊結(jié)構(gòu)、輔酶結(jié)合位點和催化活性位點等[17]。氨基酸序列比對的結(jié)果顯示，福建牡蠣17β-HSD屬于11亞型，與其他物種的氨基酸序列具有較高的同源性。QRT-PCR的結(jié)果表明，福建牡蠣性腺中17β-HSD基因的表達量高于其他組織，原位雜交的結(jié)果進一步顯示17β-HSD基因主要表達在卵巢的濾泡細胞上。本研究還發(fā)現(xiàn)，福建牡蠣性腺中17β-HSD的表達量高低與性腺發(fā)育階段密切相關(guān)，但其變化趨勢卻與性類固醇激素含量相反。我們推測這可能是由于其屬于11亞型，主要起氧化酶的作用。在福建牡蠣性腺成熟前，該基因的表達量較低，氧化作用弱，雌激素和雄激素更多地以有活性的雌二醇和睪酮的形式存在，以便促進性腺的進一步發(fā)育，而當配子排放后性腺發(fā)育暫停，17β-HSD11基因的表達量顯著提高，使得雌二醇和睪酮被轉(zhuǎn)化為雌酮和雄烯二酮，導致雌二醇和睪酮的含量顯著下降。Matsumoto等用放射性同位素標記的方法發(fā)現(xiàn)太平洋牡蠣中17β-HSD將雌二醇轉(zhuǎn)化為雌酮的活性顯著高于將雌酮轉(zhuǎn)化為雌二醇的活性[5]，這也佐證了我們之前的假設(shè)。此外，本次研究還發(fā)現(xiàn)，除性腺外，17β-HSD基因在福建牡蠣其他組織中(包括外套膜、鰓、閉殼肌和內(nèi)臟團)也均有表達，這說明該種酶在牡蠣中可能與在其他脊椎動物和無脊椎動物中一樣，具有多重生物學功能[18]。已有研究證實脊椎動物肝臟和腎臟中的17β-HSD可以催化長鏈脂肪酸的β-氧化[19]，而本實驗也發(fā)現(xiàn)福建牡蠣17β-HSD基因在內(nèi)臟團中表達量較高，這說明其可能參與了牡蠣的脂肪代謝過程。類似的結(jié)果在櫛孔扇貝[16,20]和狗巖螺[13]中也有報道。

3 結(jié)論

綜上，本研究通過分子生物學的方法克隆獲得了福建牡蠣性類固醇激素合成酶重要基因17β-HSD的全長，并研究了其序列結(jié)構(gòu)特征和時空表達模式，推測17β-HSD可能參與了牡蠣性類固醇激素合成過程中的不同生化反應，是牡蠣性類固醇激素合成過程中的關(guān)鍵酶，對調(diào)節(jié)牡蠣性類固醇激素的合成起著重要的作用。