常壓敞開式離子化質譜在腫瘤診斷中的研究進展

張佳玲

(德克薩斯大學奧斯汀分校 化學系，德克薩斯 奧斯汀 78712，美國)

近年來，質譜技術憑借其本身具有的靈敏度高、特異性強和分析速度快的優勢，在臨床診斷中的應用越來越廣泛。質譜在臨床領域，如新生兒疾病篩查[1]、甾體激素檢測[2]、微生物檢測[3]、呼吸物檢測[4]等中的應用，相關綜述均進行了詳盡闡述。目前，質譜在腫瘤診斷方面常見的技術主要包括液相色譜-質譜聯用(Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)和基質輔助激光解吸電離質譜(Matrix-assisted laser desorption-ionization mass spectrometry，MALDI-MS)。自2004年常壓敞開式離子化質譜(AIMS)被報道以來，該技術領域近幾年在腫瘤診斷中的應用越來越受到關注。在過去的多年間，已有多篇AIMS相關的綜述報道[5-6]。本文結合前期研究工作，主要針對不同AIMS技術在人體腫瘤，尤其是腫瘤診斷中的研究進行了總結，并展望了該技術在未來發展的可能趨勢。

1 基于噴霧的AIMS

1.1 解吸附電噴霧離子化(DESI)

Cooks課題組于2004年報道了具有開創意義的解吸附電噴霧離子化質譜(Desorption electrospray ionization mass spectrometry，DESI-MS)[7]。目前DESI技術已廣泛應用于各個不同的領域，并且有多篇綜述對其進行了總結[6，8-9]。最早見于報道的將DESI-MS應用于癌癥組織分析是在2005年，Wiseman等[10]對人肝腺轉移癌進行了分析，在正離子模式下，DESI-MS質譜圖顯示肝癌組織樣品中鞘磷脂的峰強度高于正常組織樣品。2009年，DESI-MS對人體乳腺癌樣品的組織成像首見報道[11]。目前，DESI-MS是最廣泛地被應用于人類癌癥組織分析的技術之一，其應用涉及乳腺癌[12]、腦癌[13-17]、肝癌[10]、前列腺癌[18-19]、腎癌[20]、膀胱癌[20]、胃癌[21-22]、結直腸癌[23-24]、甲狀腺癌[25]、皮膚癌[26]、肺癌[27-28]及淋巴轉移癌[21，29]等。需指出的是，以上應用均處于研究階段，并未經美國食品藥品管理局(FDA)批準，因此均未被應用于實際臨床診斷。

再帕爾·阿不力孜課題組于2011年報道了空氣動力輔助離子化技術(Air flow-assisted ionization，AFAI)，也稱為空氣動力輔助解吸附電噴霧離子化技術(Air flow-assisted desorption electrospray ionization，AFADESI)，該技術可實現開放環境下離子的遠距離傳輸，消除樣品檢測的空間限制和增加分析的靈活性[30]。在腫瘤組織診斷方面，該實驗室也對不同疾病展開了研究。2015年，Li等[31]利用AFADESI對52個人肺癌樣品進行分析，發現了脂類、氨基酸、膽堿、多肽以及左旋肉堿等生物標記物，并且靈敏度和特異性可分別達到93.5%和100%。2016年，Mao等[32]利用AFADESI對乳腺癌中2種非常重要的乳腺導管原位癌和浸潤性導管癌進行了區分。而在最近，Sun等[33]通過對256例食管癌病人的分析，詳細討論了來自不同代謝通路的多種代謝物分子。值得一提的是，研究者發現Pyrroline-5-carboxylate reductase 2(PYCR2)和Uridine phosphorylase 1(UPase1)這2個代謝通路與食道鱗狀細胞癌相關。

在DESI成像方面，本課題組在過去幾年間分別對胃癌，嗜酸細胞瘤和甲狀腺癌展開了研究。2012年，Eberlin等[22]對術中胃癌組織快速冷凍樣品進行了分析，以幫助外科醫生術中快速診斷，為確認癌癥邊緣提出了新的解決方案。該研究對62例組織庫的人胃部樣品進行分析，通過統計學方法對所獲得的12 480個質譜成像數據進行訓練，尋找重要的生物標記物，建立統計學預測模型，經過一系列優化，可獲得近98%的準確率。不僅如此，利用該統計學模型，對21例實際術中胃部邊緣樣品進行預測，結果顯示可以獲得與病理學專家相當的結果。

嗜酸細胞瘤(Oncocytic tumor)是一類少見的良性腫瘤，細胞層面表現為線粒體的過度積累。已有研究表明，這類腫瘤的發生與線粒體DNA的突變相關，然而對于該類腫瘤細胞的脂質分子信息的研究目前尚未見報道。利用DESI質譜成像，本實驗室對正常甲狀腺樣品、嗜酸細胞瘤和非嗜酸細胞瘤3種不同的樣品組織進行了分析[25]。結果顯示，在嗜酸細胞瘤中有一類特殊的分子——心磷脂在其中的含量遠高于另外2種組織。心磷脂分子相比于其他脂類分子的特殊之處在于它可同時攜帶2個電荷。此外，研究還發現了17種被氧化的心磷脂分子，且只存在于嗜酸細胞瘤中。采用不同的染色方法交叉驗證質譜的實驗結果，如免疫組織化學染色法(Immunohistochemistry，IHC)和熒光染色，均得到與質譜成像一致的結果(圖1)。

圖1 DESI成像和甲狀腺線粒體分離實驗流程[25]

甲狀腺結節的發病率近些年在許多國家逐年攀升。然而，臨床上對該疾病穿刺樣品是否為癌癥的診斷仍較為困難，由于樣品中細胞數量較低或形態不規則，占該類疾病20%的樣品往往只能夠給出不確定的診斷結果。盡管基因組技術逐漸被應用于該類疾病的診斷，但效果仍然有限。本實驗室通過對178個病人組織樣品，包括正常組織、良性濾泡狀腺瘤(Benign follicular adenoma，FTA)、惡性濾泡狀腺瘤(Malignant follicular carcinoma，FTC)和乳突癌(Papillary carcinoma，PTC)使用DESI成像技術進行分析，共獲得了114 125個質譜圖數據[34]，對這些數據進行訓練，所獲得的統計學模型被用來預測臨床上的穿刺樣品，可得到大約90%的預測準確率，證明了質譜成像不僅可用于組織樣品分析，在細胞分析上也有其獨特的應用。

1.2 探針電噴霧/紙噴霧/生物組織噴霧/指診噴霧(PESI/Paper Spray/Tissue Spray/Swab Touch)

基于探針的質譜技術研究在近幾年逐漸引人關注，其基本原理存在一定相似之處，即均需制作帶有尖端的探針。早在1999年，中山大學謝建臺課題組[35]就報道了無需毛細管，只需銅線即可產生電噴霧的離子化裝置。2010年，歐陽證課題組[36]報道了紙噴霧離子化(PS)質譜。PS的工作原理是將紙剪成帶有尖端的形狀，將所要分析的樣品在紙片上進行上樣，當在紙片上滴加溶劑并施以高壓時，紙片尖端會產生電噴霧，從而將樣品離子化。PS被廣泛用于血液、尿液、唾液、糞便等樣品的分析[37-38]。此后，一系列相似原理的技術相繼被報道。2013年，Mandal等[39]使用探針電噴霧(Probe electrospray ionization，PESI)對4例正常和癌變的結腸樣品進行分析，通過主成分分析可清晰地將兩者區分。2015年，Kerian等[40]在前列腺組織樣品表面使用棉棒進行簡單接觸，通過指診噴霧(Touch spray)對來自6個前列腺病人的70個樣品進行非靶向分析，最終所獲得的110個數據的準確率為93%。2017年，Pirro等[41]利用指診噴霧對29個人體膠質母細胞瘤進行了分析，在指診噴霧的圖譜中可清晰地觀察到重要的生物標記物N-Acetylaspartate(NAA)。而對2-Hydroxyglutarate(2HG)的表征則可以用來評估Isocitrate dehydrogenase(IDH)突變的狀態，因此該方法在手術中的快速診斷方面具有很大的應用潛力。在基于探針的方法中，還有一種方法為生物組織噴霧(Tissue spray)，該方法直接利用樣品組織在尖端產生噴霧而將樣品離子化。Kononikhin等[42]使用該方法，利用豐富的脂質信息，對人體腦壞死組織和腦瘤組織的質譜圖進行了對比，證明了該方法具有區分不同組織的潛力。2015年，Wei等[43]使用38組人體肺部樣品，通過組織噴霧，對肺部鱗狀細胞癌(Lung squamous cell carcinoma)以及相鄰正常組織進行了分析，在統計學方法的輔助下，使用偏最小二乘判別分析(Partial least squares linear discriminant analysis，PLS-LDA)，對癌癥的判別準確率達94.42%，并且整個分析過程可在1 min內完成。2018年，Adamyan等[44]使用組織噴霧對子宮內膜異位癥(Endometriosis)、腹膜子宮內膜異位癥和正常子宮內膜3種樣品進行了質譜表征，并討論了3種組織中具有顯著差異的15種不同的脂類分子。

2 基于電燒蝕的AIMS：快速揮發電離質譜(REIMS)

2009年，Zoltan實驗室[45-46]報道了一種快速揮發電離質譜(Rapid evaporative ionization mass spectrometry)，也稱為智能手術刀(iKnife)。該技術的工作原理是：首先對所要分析的樣品進行電燒蝕(Cauterization)，電燒蝕過程中會產生含有樣品的氣溶膠，通過文丘里空氣泵(Venturi pump)將氣溶膠導入自制的離子源中進行離子化，最終進入質譜，從而得到待分析樣品的分子信息。2017年，St John等[47]利用iKnife對多發性乳腺癌展開了研究，該研究中對正常乳腺組織樣品和腫瘤組織使用線性判別分析(Linear discriminant analysis，LDA)建立了統計學模型，932個樣品數據可獲得93.4%的靈敏度和94.9%的特異性。利用該模型，對另外161個正常樣品和99個腫瘤樣品進行了預測，獲得了90.9%的靈敏度和98.8%的特異性。該技術術中操作以及數據分析過程可在短短的1.8 s內完成。2018年，Phelps等[48]對來自198例人體卵巢癌的335個樣品組織進行了分析，交叉驗證結果顯示對正常卵巢樣品和卵巢癌樣品的辨別可達到97.4%的靈敏度和100%的特異性。而對具有非常重要臨床意義的卵巢癌邊緣樣品的鑒別，靈敏度和特異性仍高達90.5%和89.7%。此外，該研究還發現了5個磷脂酸和磷脂酰乙醇胺脂質分子在卵巢癌樣品中的含量遠高于正常或者邊緣卵巢樣品。

3 基于激光的AIMS

3.1 SpiderMass

SpiderMass是在2016年被Fourier實驗室報道[49]的基于激光的質譜分析技術。Fatou等認為該技術的工作原理是通過使用共振紅外激光對所要分析的樣品進行解吸附，樣品本身存在的水分子作為基質，以類似于基質輔助激光解吸/電離的過程產生離子，借助質譜本身的真空直接被導入質譜。在首篇報道中，采用SpiderMass對人體的皮膚進行了分析，并對采集的不同性別數據進行了主成分分析。2018年，Saudemont等[50]采用該技術對體外犬類肉瘤組織進行了研究，并對正常、腫瘤和壞死組織進行了區分和鑒定，準確率高達97.63%。此外，還對發現的可能生物標記物進行了多級質譜以及質譜成像分析。

3.2 飛秒紅外激光常壓敞開式離子化質譜(PIRL)

2015年，Zarrine-Afsar實驗室利用皮秒紅外激光(Picosecond infrared laser，PIRL)在切除組織時不會造成熱損傷這一特性，將其與電噴霧相結合(PIRL-LAESI)對生物樣品進行分析[51]，發現PIRL的垂直分辨率為20～30 μm，水平分辨率約100 μm，且該技術可同時獲得脂質分子和蛋白質分子的質譜信號。2017年，Woolman等[52]將該裝置進一步簡化，使用手持式PIRL激光裝置，再通過聚四氟乙烯導管與質譜直接相連，將產生的離子最終導入質譜分析儀。最近，Woolman等[53]探究了使用PIRL-MS對髓母細胞瘤利用分子信息做術中快速判斷腫瘤亞類的可能，研究對來自113個病人的樣品進行分組，其中71例為訓練組，42例為獨立驗證組，使用主成分分析-線性判別分析(Principal component analysis with linear discriminant analysis，PCA-LDA)，訓練組的預測準確率可達95%，驗證組的預測準確率高達98.9%。

4 基于液相固相萃取的AIMS

在AIMS領域中，利用液相固相萃取原理的技術包括液體表面萃取分析(Liquid extraction surface analysis，LESA)[54]和液體微界面表面取樣探針(Liquid microjunction-surface sampling probe，LMJ-SSP)[55]。 然而，以上技術在腫瘤組織分析方面的相關工作鮮見報道。2017年，本實驗室報道了一項名為質譜筆的技術，利用該技術主要針對腫瘤組織診斷開展了相關研究工作。

4.1 質譜筆用于組織的無損傷分析

2017年，本實驗室報道了可用于ex vivo或者in vivo生物樣品癌癥診斷的質譜筆(MasSpec pen)技術[56]。質譜筆的工作原理是：首先筆的末端與樣品表面接觸，通過腳踏板的觸發，由注射泵自動在筆末端的凹槽內以脈沖的方式注射一滴10 μL水滴，該水滴與樣品進行3 s的萃取后，含有生物樣品分子的水滴會通過直接連接質譜進樣口的管路，在未經過外接離子源的情況下，直接進入質譜中被離子化(圖2)。需指出的是，該技術的離子化機理尚不完全清楚，仍有待研究。研究分析了20例人體樣品的組織切片以及253例人體組織樣品，包括甲狀腺、肺、乳腺以及卵巢的正常和癌癥樣品。在不同人體樣品中，質譜筆可檢測到豐富的分子信息，包括低分子量的代謝物分子、脂類，甚至是蛋白分子。采用統計學方法對所獲得的質譜數據進行分析，結果顯示對正常組組織和癌癥組織區分的靈敏度和特異性分別達到96.4%和96.2%，準確率為96.3%。最后，對活體小鼠進行分析，發現分析過程不會對小鼠造成任何明顯的損傷。

圖2 質譜筆裝置示意圖[56]

4.2 質譜筆用于分析卵巢癌

卵巢癌是一類具有轉移性并且致死率較高的癌癥，尤其以高分化漿液性卵巢癌(High-grade serous carcinoma，HGSC)和低分化漿液性卵巢癌(Low-grade serous carcinoma，LGSC)最為常見。本實驗室利用最近發明的質譜筆技術(圖3)對該疾病展開了詳細研究[57]，對138個卵巢樣品(71個正常，60個HGSC，7個LGSC)進行了分析。統計學模型顯示，對于正常和HGSC的區分可獲得96.7%的靈敏度和95.7%的特異性，對于正常和所有分析的癌癥組織的區分可獲得94.0%的靈敏度和94.4%的特異性。值得一提的是，該研究還對高分辨Orbitrap和低分辨的離子阱2種高低端儀器進行了比較，發現使用分辨率較低的質譜對于20個正常卵巢樣品和20個HGSC樣品可以得到100%的準確率。

圖3 質譜筆對卵巢樣品的分析[57]

5 展 望

AIMS具有簡單，可在開放環境下操作，無需或者只需很少的樣品制備等優勢，經過多年的發展，已經成功應用于眾多生物、化學分析領域，尤其是臨床領域研究。需再次指出的是，目前還沒有一項AIMS技術得到美國食品藥品管理局FDA的認證。已報道的AIMS方法有30多種，并且科學家仍然在不斷地對離子化裝置進行改進，以提高易用性和自動化。本文針對幾種不同類型的AIMS技術，結合本實驗室的研究，對其在腫瘤診斷中的應用進行了總結和整理。未來將AIMS應用于臨床仍然任重道遠，面臨如定量能力、基質效應、數據的代表性/指紋圖譜的可靠性等一些嚴峻的問題。AIMS與傳統的液相色譜-質譜聯用或氣相色譜-質譜聯用可形成優勢互補，存在的問題可以相互佐證。未來隨著AIMS技術分析的標準化和規范化的增強，結合目前的大數據分析，相信AIMS的穩定性和可靠性也一定會進一步得到提升。此外，小型化質譜已經成為目前該領域研究的最熱點之一。將AIMS的原位分析能力與小型質譜的便攜功能結合，將會極大地促進該技術在臨床領域中的應用。