Paternò-Büchi(PB)反應(yīng)與串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合實(shí)現(xiàn)不飽和脂質(zhì)精確結(jié)構(gòu)解析

馬瀟瀟，胡清源，瑕 瑜

(1.清華大學(xué) 精密儀器系 精密測(cè)試技術(shù)及儀器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084；2.清華大學(xué) 化學(xué)系，北京 100084)

本文主要介紹基于PB反應(yīng)的脂質(zhì)分析的基本原理，以及適用于脂質(zhì)衍生化的電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)實(shí)驗(yàn)設(shè)置。以不同類(lèi)型脂質(zhì)(如甘油磷脂、脂肪酸和膽固醇酯)為例，介紹了脂質(zhì)結(jié)構(gòu)解析和定量分析的基本方法。該方法既可直接用于鳥(niǎo)槍脂質(zhì)組學(xué)分析，也可與液相色譜聯(lián)用。本衍生方法無(wú)需對(duì)質(zhì)譜儀器做改造，通過(guò)紫外光源即可在離子源處實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)快速衍生化，裝置簡(jiǎn)單，譜圖易解，有望在各類(lèi)脂質(zhì)分析中獲得廣泛應(yīng)用。

1 Paternò-Büchi反應(yīng)

圖1 油酸和丙酮間的PB及逆反應(yīng)

2 PB反應(yīng)與ESI-MS聯(lián)用

2.1 光化學(xué)反應(yīng)器

常規(guī)用于有機(jī)合成的PB反應(yīng)體系通常體積較大[28-32]，量子產(chǎn)率也較低(0.01～0.1)，因此需要高濃度的反應(yīng)試劑(mmol/L到mol/L)、較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間(3～24 h)和非極性溶劑條件[33]。然而，這些反應(yīng)條件與電噴霧離子化不兼容。為將PB反應(yīng)與ESI-MS聯(lián)用，本課題組發(fā)展了流式微反應(yīng)器和nanoESI在線(xiàn)反應(yīng)兩種分析模式。

2.1.1 流式微反應(yīng)器發(fā)展流式微反應(yīng)器(Flow microreactor)主要目的是使光衍生反應(yīng)時(shí)間可調(diào)，使其能與常規(guī)ESI分析聯(lián)用。流式微反應(yīng)器采用內(nèi)徑 <1 mm的毛細(xì)管作為流道，可實(shí)現(xiàn)對(duì)UV照射時(shí)間的準(zhǔn)確控制以及較高的光子效率，并可減少由過(guò)度或不均勻UV照射導(dǎo)致的副產(chǎn)物的生成。經(jīng)過(guò)不斷優(yōu)化，目前一般采用可透過(guò)UV輻射的熔融石英毛細(xì)管作為反應(yīng)流道(外徑363 μm，內(nèi)徑100 μm)。該裝置的流速可調(diào)范圍較大：從亞μL/min到亞mL/min[34-35]。將毛細(xì)管以0.5 cm間距繞在UV燈上(反應(yīng)時(shí)間>10 s)，或與UV燈距離0.5 cm保持平行(圖2A)。UV照射5 s后，PC 16∶0/18∶1(9Z)(5 μmol/L，在70∶30丙酮/水溶液中，1%乙酸)衍生化產(chǎn)物的離子強(qiáng)度基本與底物相當(dāng)，轉(zhuǎn)化率約為50%。這種反應(yīng)裝置可以提供比體相反應(yīng)更高的產(chǎn)率，并顯著減少副反應(yīng)。在該類(lèi)型的反應(yīng)器中，UV照射5 s后，反應(yīng)即基本達(dá)到平衡。反應(yīng)器的流速范圍(100 nL/min～50 μL/min)恰好與常規(guī)ESI-MS進(jìn)樣的流速相當(dāng)，因而兩者可以很好地聯(lián)用。

2.1.2 nanoESI在線(xiàn)反應(yīng)在nanoESI在線(xiàn)模式下，衍生化反應(yīng)在nanoESI噴針中進(jìn)行。反應(yīng)前，將5～10 μL不飽和脂質(zhì)溶液(溶劑：50∶50丙酮/水,體積比)加入噴針中。采用發(fā)射波長(zhǎng)254 nm的低壓汞燈作為激發(fā)光源。反應(yīng)裝置示意圖如圖2B所示。盡管硼硅酸鹽玻璃對(duì)254 nm的UV光不透明，但噴針的尖端玻璃壁厚已降至μm水平，透光率大大增加，因而使得反應(yīng)可在此處發(fā)生。丙酮既作為PB試劑，也作為nanoESI溶劑。以PC 16∶0/18∶1(9Z)(10 μmol/L，溶于50∶50 丙酮/水中，1%乙酸)為例，UV照射1～2 min后，在 +58 Da的位置清晰檢測(cè)到光衍生化產(chǎn)物(m/z818.6)。從提取離子流圖(XIC)可見(jiàn)，反應(yīng)在1 min內(nèi)即達(dá)到穩(wěn)態(tài)。除PB產(chǎn)物外，一般還會(huì)檢測(cè)到少量由丙酮的諾里斯類(lèi)型1斷裂和后續(xù)氧化所產(chǎn)生的副產(chǎn)物。nanoESI硼硅酸鹽玻璃噴針的使用大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)裝置的設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)裝置和離子源一體化。但由于nanoESI噴針中的脂質(zhì)溶液受電滲流驅(qū)動(dòng)，因此該裝置僅對(duì)較小的流速范圍(20 ～100 nL/min)適用[36]。

圖2 兩種反應(yīng)器的脂質(zhì)衍生化產(chǎn)率及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)效果比較

在常規(guī)有機(jī)反應(yīng)中PB反應(yīng)通常需在mL級(jí)的有機(jī)溶劑中反應(yīng)數(shù)小時(shí)，無(wú)法直接與ESI-MS聯(lián)用。使用nanoESI-噴針?lè)磻?yīng)器或者流式微反應(yīng)器極大地提高了PB 反應(yīng)和分析的速度。PB反應(yīng)和在線(xiàn)MS分析在20～30 s即可完成，僅需數(shù)μL脂質(zhì)溶液。丙酮作為PB反應(yīng)試劑具有與大部分溶劑混溶、廉價(jià)易得、可直接作為電噴霧溶劑等優(yōu)點(diǎn)。而與nanoESI-噴針?lè)磻?yīng)器相比，流式微反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)動(dòng)力學(xué)可精確控制、產(chǎn)率高、副反應(yīng)少。更重要的是，后者能在較寬的流速范圍內(nèi)與ESI-MS及LC-MS聯(lián)用[37]。

2.2 溶 劑

選擇合適的溶劑對(duì)脂質(zhì)的高效PB衍生化非常關(guān)鍵。合適的溶劑應(yīng)該至少具備溶解性好和對(duì)紫外光呈惰性?xún)蓚€(gè)特點(diǎn)。例如，對(duì)脂肪酸和極性脂質(zhì)(甘油磷脂(GPs)和鞘磷脂(SMs)等)而言，丙酮/水是最佳的溶劑體系。在丙酮/水中，PB反應(yīng)的產(chǎn)率較高，同時(shí)丙酮/水也是良好的電噴霧溶劑。在溶解性方面，濃度在～100 μmol/L的脂質(zhì)均可溶于丙酮/水。而對(duì)非極性脂質(zhì)(如糖脂和固醇酯)而言，丙酮/水并非最佳的溶劑體系。例如，用于膽固醇酯(CE)在線(xiàn)衍生化的最佳溶劑體系是含有100 μmol/L LiOH的丙酮/甲醇/二氯甲烷/水(40∶30∶20∶10,體積比)體系[38]。

2.3 副反應(yīng)

254 nm UV輻射會(huì)導(dǎo)致丙酮發(fā)生諾里斯類(lèi)型1斷裂[39-40]，產(chǎn)生乙酰基(·C(O)CH3)和甲基(·CH3)。這些自由基會(huì)從脂肪酰/烷鏈中捕獲丙基氫，產(chǎn)生脂質(zhì)自由基。脂質(zhì)自由基會(huì)繼續(xù)與甲基或乙酰基結(jié)合，產(chǎn)生穩(wěn)定取代產(chǎn)物。為了有效減少諾里斯類(lèi)型1副反應(yīng)對(duì)脂質(zhì)分析的不利影響，可適當(dāng)減少紫外光照射時(shí)間。盡管反應(yīng)產(chǎn)率會(huì)有所下降，卻可以大大降低副反應(yīng)的干擾。此外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，如果在溶劑體系中加入乙醇等醇類(lèi)物質(zhì)，也會(huì)在降低PB反應(yīng)產(chǎn)率的同時(shí)，提高反應(yīng)的選擇性，這對(duì)于多不飽和脂質(zhì)的分析往往是有利的。但要注意醇類(lèi)物質(zhì)也會(huì)被自由基奪氫，并繼續(xù)與不飽和脂質(zhì)反應(yīng)。導(dǎo)致副產(chǎn)物生成的另一個(gè)因素是氧氣。一般而言，PB反應(yīng)需在無(wú)氧條件下進(jìn)行。如果存在氧氣，反應(yīng)過(guò)程中所產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基會(huì)迅速與氧氣反應(yīng)，生成過(guò)氧化產(chǎn)物[41]，其在抑制PB反應(yīng)的同時(shí)會(huì)降低分析靈敏度。

2.4 典型PB反應(yīng)規(guī)律

圖3 幾種典型脂質(zhì)的衍生質(zhì)譜圖

3 利用PB-MS/MS分析不同類(lèi)型脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)

3.1 脂肪酸的分析

圖4 油酸(FA 18∶1(9Z))PB產(chǎn)物的碎裂規(guī)律及特征離子結(jié)構(gòu)

3.2 不飽和甘油磷脂的分析

圖5 脂質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的一般流程：PS 16∶1/18∶1在負(fù)離子模式下的PB-MS/MS譜圖(A)，A中m/z 339.3處對(duì)應(yīng)離子的MS3譜圖(B)，A中m/z 311.2處對(duì)應(yīng)離子的MS3譜圖(C)，PE 16∶1/18∶1的MS/MS譜圖(D)，在m/z 714.6處的去質(zhì)子PE 16∶1/18∶1的MS/MS譜圖(E)，PE 16∶1/18∶1在正離子模式下的PB-MS/MS譜圖(F)

3.3 膽固醇酯的分析

3.4 脂質(zhì)位置異構(gòu)體的定量分析

4 鳥(niǎo)槍脂質(zhì)分析法

圖6 通過(guò)PB-MS/MS對(duì)脂質(zhì)異構(gòu)體進(jìn)行定性和定量分析：不同摩爾比例(在右邊指出)的FA 18∶1的Δ9和Δ11混合物的PB-MS/MS分析(A);建立在FA 18∶1的Δ9和Δ11異構(gòu)體的診斷離子比例(I11Z/I9Z)和摩爾比例(C11Z/C9Z)間的線(xiàn)性關(guān)系(B);以FA 18∶1(6Z)作為內(nèi)標(biāo)定量FA 18∶1的Δ9和Δ11異構(gòu)體的標(biāo)定曲線(xiàn)(C)

5 PB反應(yīng)與質(zhì)譜成像

6 結(jié)論與展望