沉香的高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜數字化指紋圖譜研究

吳惠勤，黃 芳，黃曉蘭，羅輝泰，謝淑桐，周 熙

(中國廣州分析測試中心 廣東省分析測試技術公共實驗室，廣東 廣州 510070)

沉香由瑞香科植物白木香樹產生，主產地在中國南方及東南亞，是一種珍貴的中藥材[1]。現代研究表明，沉香在治療消化系統疾病、呼吸系統疾病、心腦血管疾病、神經系統疾病以及外科、婦科、兒科、五官科和皮膚科疾病等方面均有顯著療效，在抗腫瘤、抗風濕病以及美容等方面亦有較好的作用[2-5]。可見，沉香的藥理作用和臨床應用范圍十分廣泛，具有廣闊的開發應用前景。

有研究表明沉香中的特征性成分主要由倍半萜類揮發性成分(占52%)和2-(2-苯乙基)色酮類難揮發性成分(占41%)[6]組成。沉香的氣味主要由揮發性成分構成，通常采用氣相色譜-質譜(GC-MS)法進行成分研究[7-9]。吳惠勤等[10-12]采用固相微萃取/氣相色譜-質譜(SPME/GC-MS)測定了沉香的香氣成分，基本闡明了揮發性的化學成分。對于難揮發性成分的研究，主要采用液相色譜及液相色譜-質譜法[13-14]，楊錦玲等[15]測定了不同結香方法所得沉香的色酮含量，發現其含量差異大。有學者研究沉香的液相色譜指紋圖[16-18]，發現藥材產地、結香方法和時間均可導致成分差異和質量差異。現行《中國藥典》[19]規定沉香的定量指標為沉香四醇，另外規定沉香的特征液相色譜圖中須含有6個特征峰，其中1、3、5號峰給出了化合物名稱，其余均為未知化學成分。中藥發揮藥效的物質基礎是化學成分，目前沉香中有很多難揮發成分的化學結構尚不清楚，給中藥的質量評價和質量控制帶來困難，影響中藥的現代化進程。為研究沉香中這些成分的化學結構，本研究采用高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯用(HPLC-Q-TOF-MS)法測定其組成，同時采集色譜及質譜數據，得到高分辨飛行時間質譜(TOF-MS)總離子流色譜圖和液相色譜-紫外檢測圖(HPLC-UV)，用Qualitative Navigator B.08.00軟件識別總離子流色譜圖中各色譜峰的精確質量數(精確至小數點后第四位)，并標注在色譜峰上，即得到每個色譜峰具有唯一性的數字化信息。進一步通過計算機軟件推算出每個精確質量數的元素組成(分子式)，結合二級質譜子離子的質譜數據及文獻報道推斷出化學結構，從沉香中共鑒定了30個難揮發性成分，達到以數字化形式表征化學成分的目的。本文首次提出并構建了沉香的數字化的HPLC-UV/TOF-MS指紋圖，對色譜圖中每種化學成分給出了類似于身份證的數字化信息，具有唯一性，且主要成分均鑒定出化學結構，全面地表征了沉香的物質組成。本研究為沉香的質量綜合評價提供了可行方法，也為藥理、藥效研究及質量標準研究奠定了基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290 HPLC-6540-Q-TOF-MS配有雙噴射流電噴霧離子源(美國安捷倫公司)；賽多利斯TP-114電子天平(美國Sartorious公司)；KQ2200型臺式機械超聲波清洗器(東莞市超聲波設備有限公司)；甲醇、乙醇、乙腈(HPLC級，德國Merck公司)，實驗用水為二次蒸餾水，甲酸(阿拉丁試劑有限公司)。沉香四醇對照品(批號19020131)、沉香對照藥材(批號121222-201203)均購于中國食品藥品檢定研究院;沉香樣品由江門粵怡沉香科技公司提供。

1.2 實驗方法

將沉香藥材粉碎，精密稱取0.2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入10 mL乙醇，稱定質量，浸泡0.5 h，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz ) 1 h，放冷，再次稱定質量，用乙醇補足損失的質量，搖勻，靜置，取上清液過濾，濾液待上機分析。

1.3 液相色譜條件

色譜柱：Phenomenex luna C18(25 cm×4.6 mm×5 μm)；流動相：以乙腈為流動相A，0.1%甲酸溶液為流動相B。梯度洗脫程序：0～10 min，15%～20%A；10～19 min，20%～23%A；19～21 min，23%～33%A；21～39 min，33%A；39～40 min，33%～35%A；40～50 min，35%A；50.1～60 min，95%A；60～66 min，95%～15%A。流速為0.7 mL/min，紫外檢測波長為252 nm。

1.4 質譜條件

離子源為Agilent雙噴Jet Stream源(Dual Jet Stream ESI)，正離子模式采集，干燥氣(N2)溫度：350 ℃，霧化氣(N2)壓力：275.8 kPa，流速：8 L/min，鞘氣溫度：350 ℃，流速：11 L/min，毛細管電壓：3 000 V，毛細管出口電壓(Fragmentor)：110 V，錐孔電壓(Skimmer)：65 V，八極桿電壓：750 V，采集模式為自動MS/MS，掃描范圍：m/z80～1 100 u；參比離子：m/z121.050 9、922.009 8。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

沉香在正離子模式掃描過程中各成分均形成[M+H]+的準分子離子峰，二級質譜碎裂生成子離子；負離子模式掃描過程中各成分丟失質子形成[M-H]-的準分子離子峰，但響應值比正離子模式低，因此本實驗采用正離子掃描模式進行檢測。

2.2 紫外色譜圖及總離子流圖的測定

沉香的前處理方法和液相色譜條件參照《中國藥典》2015版[19]沉香項下，采用高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯用儀測定，同時采集紫外檢測數據，樣品的高分辨質譜總離子流(TIC)圖見圖1。與紫外色譜圖(圖略)相比，相同保留時間色譜峰的豐度有較明顯差異，UV圖中部分峰明顯偏低，主要是由于檢測機理不同使得響應強弱不同所致。

圖1 沉香的質譜總離子流圖

2.3 精確質量數的識別及數字化指紋圖的建立

經高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯用儀測得沉香的總離子流質譜數據，對圖1中各色譜峰進行精確質量數識別，以該色譜峰豐度最高的質譜峰所對應的精確質量數為該峰的準分子離子峰(母離子)，每個母離子均為[M+H]+離子，因此以該準分子離子的精確質量數表示該色譜峰的質量數(精確到小數點第4位)，識別出TIC圖中30個色譜峰的精確質量數。由于UV圖及TIC圖中保留時間相同的峰為同一物質，因此可將精確質量數標注在UV圖上，然后確定各精確質量數的分子式，并進一步鑒定其化學結構，從而得到數字化的色譜-質譜指紋圖(見圖2及圖3)，可表征沉香的化學成分。

圖2 沉香的HPLC-TOF-MS數字化指紋圖譜

圖3 沉香的HPLC-UV數字化指紋圖譜

圖4 2-(2-苯乙基)色酮類成分的裂解途徑

2.4 數字化指紋圖中成分鑒定

進一步分析“2.3”的沉香色譜-質譜指紋圖，利用儀器定性分析軟件對各峰對應的精確質量數進行分析，推測出最有可能的分子式并確定離子的狀態，然后逐個研究其二級質譜的碎片離子、丟失基團、質譜裂解規律，推斷化合物的可能結構式，用對照品進行質譜測定，確證各個成分的化學結構。最終，從沉香中共鑒定出30個化學成分，結果見表1。

研究結果顯示，沉香的主要成分為2-(2-苯乙基)色酮類物質，通過對該類化合物的裂解機理進行研究，發現其母核結構的裂解規律(見圖4)。以下對5、18、28號色譜峰進行了詳細的質譜解析。

5號峰(保留時間18.49 min)的一級質譜圖見圖5A，準分子離子峰[M+H]+的精確質量數為319.118 2，推斷其分子式為C17H18O6，誤差在±5×10-6范圍內；[M+H]+319.118 2的二級質譜圖見圖5B，其主要生成碎片離子：m/z301.107 1、283.096 8、255.101 8、227.106 4、192.041 8、164.046 6、105.069 6、91.054 1等。質譜裂解規律為：準分子離子峰m/z319.118 2中的氫重排到羥基上，氧原子上的1個鍵發生斷裂，中性丟失1分子H2O ，形成m/z301.107 1[M+H-H2O]+碎片離子，然后另1個氫重排到另1個羥基上，氧原子上的1個鍵發生斷裂，再中性丟失1分子H2O形成m/z283.096 8[M+H-2H2O]+碎片離子；m/z283.096 8先發生i誘導斷裂，然后發生α斷裂，中性丟失1分子CO，形成m/z255.101 8[M+H-2H2O-CO]+碎片離子；準分子離子m/z319.118 2環上游離基中心提供1個奇電子與鄰接原子形成1個新鍵，同時該α原子的另一個鍵斷裂(α斷裂)(CH2-CH2)，形成m/z227.106 4和m/z91.054 1的碎片離子。m/z227.106 4氫重排到羥基上，氧原子上的1個鍵發生斷裂，中性丟失2分子 H2O，形成m/z192.041 8的碎片離子。m/z255.101 8[M+H-2H2O-CO]+環上游離基中心提供1個奇電子與鄰接原子形成1個新鍵，同時該α原子的另一個鍵斷裂(CH2-CH2)，形成m/z164.046 6和m/z105.069 6的碎片離子。綜合以上信息推斷5號峰(分子量為318)的化學成分為沉香四醇，精確分子量為318.110 3，分子式為C17H18O6，其裂解機理見圖6。

圖5 5號峰的一級質譜圖(A)與精確質量數319.118 2峰的二級質譜圖(B)

圖6 沉香四醇的裂解機理

18號峰(保留時間為31.95 min)的一級質譜圖見圖7A，準分子離子峰[M+H]+的精確質量數為337.083 2，推測其分子式為C17H17ClO5，誤差在±5×10-6范圍內；[M+H]+337.083 2的二級質譜圖見圖7B，其主要生成碎片離子：m/z319.073 4、301.062 4、283.096 2、265.085 4、192.041 2、91.053 6等。質譜裂解規律為：準分子離子峰m/z337∶m/z339 的豐度比約3∶1，可見分子中含有1個氯原子，準分子離子m/z337.083 2環上游離基中心提供1個奇電子與鄰接原子形成1個新鍵，同時該α原子的另1個鍵斷裂(α斷裂)(CH2-CH2)，形成m/z319.073 4和m/z91.053 6的碎片離子。準分子離子m/z337.083 2氫重排到羥基上，氧原子上的1個鍵發生斷裂，中性丟失1分子 H2O，形成m/z319.073 4 [M+H-H2O]+碎片離子，隨后另1個氫重排到另1個羥基上，氧原子上的1個鍵發生斷裂，又中性丟失1分子 H2O，形成m/z301.062 4[M+H-2H2O]+碎片離子；m/z319.073 4氫重排到氯原子上，氯原子上1個鍵發生斷裂，中性丟失1分子HCl，形成m/z283.096 2[M+H-H2O-HCl]+碎片離子;m/z301.062 4氫重排到氯原子上，氯原子上1個鍵發生斷裂，中性丟失1分子HCl，形成m/z265.085 4[M+H-2H2O-HCl]+碎片離子；碎片離子m/z283.096 2環上游離基中心提供1個奇電子與鄰接原子形成1個新鍵，同時該α原子的另1個鍵斷裂(二環之間的CH2-CH2鍵發生斷裂)，形成m/z192.041 2、91.053 6的碎片離子。綜合以上信息并結合文獻分析，推斷該成分為8-氯-2-(2-苯乙基)-5，6，7-三羥基-5，6，7，8-四氫色酮，其裂解機理見圖8。

28號峰(保留時間為46.17 min)的一級質譜圖見圖9A，準分子離子峰[M+H]+的精確質量數為283.095 9，推測分子式為C17H14O4，誤差在±5×10-6范圍內；[M+H]+283.095 9的二級質譜圖見圖9B，其主要生成碎片離子：m/z255.100 6、227.106 1、192.041 3、164.046 6、123.041 7、105.069 2、91.053 7。質譜裂解規律為：準分子離子m/z283.095 9環上游離基中心提供1個奇電子與鄰接原子形成1個新鍵，同時該α原子的另1個鍵斷裂(α斷裂)(CH2-CH2)，形成m/z192.041 3和m/z91.053 7的碎片離子；準分子離子m/z283.095 9先發生i誘導斷裂，然后發生α斷裂，中性丟失1分子CO，形成m/z255.100 6[M+H-CO]+碎片離子，再發生i誘導斷裂，隨后發生α斷裂，又失去1分子CO，形成m/z227.106 1[M+H-2CO]+碎片離子；m/z227.106 1[M+H-2CO]+的 CH2-CH2鍵發生α斷裂，形成m/z123.041 7和m/z105.069 2的碎片離子；m/z255.100 6[M+H-CO]+環上游離基中心提供1個奇電子與鄰接原子形成1個新鍵，同時該α原子的另1個鍵斷裂(α斷裂)(CH2-CH2)，形成m/z164.046 6的碎片離子。綜合以上信息并結合文獻分析，推測該成分為6,7-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮，其裂解機理見圖10。

圖7 18號峰的一級質譜圖(A)與精確質量數337.083 2峰的二級質譜圖(B)

圖8 8-氯-2-(2-苯乙基)-5，6，7-三羥基-5，6，7，8-四氫色酮的裂解機理

Fig.8 Pyrolysis mechanism of 8-chloro-2-(2-phenylethyl)-5,6,7-trihydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone

圖9 28號峰的一級質譜圖(A)與精確質量數283.095 9峰的二級質譜圖(B)

圖10 6,7-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮的裂解機理

表1 沉香指紋峰的精確質量數及其化學成分

(續表1)

PeakNo.Retentiontime(min)Accuratemassnumber(m/z)Fragmentions(m/z)StructuralformulaCompoundRelativecontent(%)1831.95337.0832319.0734,301.0624,265.0854,91.0536C17H17ClO58-Chloro-2-(2-phenylethyl)-5,6,7-trihydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone(8-氯-2-(2-苯乙基)-5,6,7-三羥基-5,6,7,8-四氫色酮)1.611932.93313.1068207.0641,107.0480C18H16O56,4′-Dihydroxy-3′-methoxy-2-(2-phenylethyl)chro-moneorisomer(6,4′-二羥基-3′-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮或異構體)0.202034.41331.1169313.1076,285.1121,121.0647,91.0539C18H18O65,6-Epoxy-7,8-dihydroxy-2-[2-(4-methoxybenzene)ethyl]chromoneorisomer(5,6-環氧-7,8-二羥基-2-[2-(4-甲氧基苯)乙基]色酮或異構體)1.082135.28301.1063283.0859,255.1009,164.0462,91.0539C17H16O55,6-Epoxy-7,8-dihydroxy-2-(2-phenylethyl)chro-mone(5,6-環氧-7,8-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮)8.712236.78237.1842219.1732,163.1105,91.0531C14H20O35,6,6-Trimethyl-5-(3-oxobutyl-1-ene)-1-oxazolo[2.5]octane-4-one(5,6,6-三甲基-5-(3-氧代丁基-1-烯基)-1-氧雜螺[2.5]辛-4-酮)0.342337.53313.1067177.0542,137.0591C18H16O56,4′-Dihydroxy-3′-methoxy-2-(2-phenylethyl)chro-moneorisomer(6,4′-二羥基-3′-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮或異構體)0.242439.86313.1077137.0605,122.0356C18H16O56,4′-Dihydroxy-3′-methoxy-2-(2-phenylethyl)chro-moneorisomer(6,4′-二羥基-3′-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮或異構體)0.172542.24313.1061163.0386,121.0566,91.0541C18H16O56,4′-Dihydroxy-3′-methoxy-2-(2-phenylethyl)chro-moneorisomer(6,4′-二羥基-3′-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮或異構體)0.322643.71283.0965255.0994,227.1049,91.0536C17H14O46,7-Dihydroxy-2-(2-phenylethyl)chromoneiso-mer(6,7-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮異構體)0.752745.23313.1067163.0387,121.0644C18H16O56,4′-Dihydroxy-3′-methoxy-2-(2-phenylethyl)chro-mone(6,4′-二羥基-3′-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮)14.112846.17283.0959164.0466,91.0537C17H14O46,7-Dihydroxy-2-(2-phenylethyl)chromone(6,7-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮)29.242947.93313.1067121.0542,91.0476C18H16O56,4′-Dihydroxy-3′-methoxy-2-(2-phenylethyl)chromoneorisomer(6,4′-二羥基-3′-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮或異構體)0.353049.78283.0959192.0417,153.0181,126.0310,91.0540C17H14O46,7-Dihydroxy-2-(2-phenylethyl)chromoneisomer(6,7-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮異構體)0.51

表2 沉香6個特征峰的化學成分

圖11 沉香的特征色譜圖

2.5 化學結構驗證

為驗證“2.4”中所鑒定化學結構的可靠性，在相同條件下測定色譜保留時間及質譜數據，若該成分與其對照品的保留時間及準分子離子峰、二級特征離子完全一致，則可判定為該化合物。如鑒定出質量數319.118 2為沉香四醇，以標準品作對照，相同條件下測定沉香四醇對照品的色譜保留時間及質譜數據。結果顯示，沉香四醇對照品及沉香樣品的保留時間均為12.88 min，且沉香四醇對照品的二級質譜圖與圖5B中的質譜離子完全相同，證明該峰為沉香四醇，結果可靠。

2.6 2015版《中國藥典》沉香項下指定特征成分的鑒定

2015版《中國藥典》沉香項下指定特征圖譜(見圖11)中的6個特征峰，只明確了第1、3、5號峰的化學名稱，與本文的數字化指紋圖譜進行對比(見圖3)，結果顯示此3個成分與鑒定一致；另3個峰的鑒定結果見表2，可為藥典標準的提升提供科學數據。

3 結 論

本文首次采用HPLC-Q-TOF-MS技術研究建立了沉香的色譜-質譜數字化指紋圖譜。沉香色譜圖中的每個峰均給出了精確質量數及二級質譜數據，并鑒定了其中30個成分的化學結構，包括《中國藥典》沉香項下特征圖譜中的未知成分。本方法系統鑒定了沉香中難揮發物質的化學成分，所構建的色譜-質譜數字化指紋圖譜能全面反映沉香的物質成分，為沉香的藥理、藥效和質量標準研究提供了科學數據。