基于液相色譜-質譜技術的腎臟代謝組學分析方法研究

劉亞琪，王中華*，何秉淑，謝 冰，霍美玲，傅文清，周 幟，再帕爾·阿不力孜，2

(1.中央民族大學 生命與環境科學學院，生物成像與系統生物學研究中心，北京 100081；2.中央民族大學 藥學院，北京 100081)

腎臟是人體重要的代謝和排泄器官，腎功能異常與多種疾病密切相關。目前，臨床診斷腎臟疾病和藥物腎毒性的常用指標為尿素氮(BUN)、血清肌酐(CR)和尿酸(Ua)，但這些指標易受性別、年齡、體重等因素的影響[1]，因此需要尋找特異性更強、靈敏度更高的生物標志物。代謝組學是研究生物體內源性小分子代謝物的整體及其變化規律的科學，是發現生物標志物的重要手段。目前，代謝組學在腎臟疾病診斷和藥物腎毒性研究中已獲得廣泛應用。但已有研究多采用血液、尿液作為分析樣本，腎臟組織代謝組學研究仍較少，而開展腎臟組織代謝組學研究有助于獲得具有組織特異性的生物標志物。

腎臟組織中的代謝物具有種類繁多、結構多樣、極性差異大等特點，對腎臟代謝組的全面分析提出了很大挑戰。目前，液相色譜-串聯質譜技術(LC-MS/MS)[2-6]因具有高靈敏度、高通量、強特異性的特點，已成為代謝組學研究中最常用的分析手段。代謝組學研究中提取組織樣本的溶劑體系主要有甲醇/水、乙腈/水、甲醇/氯仿/水、甲醇/二氯甲烷/水[7-9]。但甲醇/水、乙腈/水只能提取強極性部分，獲得的代謝物信息不夠完整；甲醇/氯仿/水體系中，氯仿具有一定的毒性和環境污染性。另外，甲醇/二氯甲烷/水在提取時，強極性部分與弱極性部分上下層分離后，固體沉積物處于中間層，易造成對下層提取物的污染。此外，目前腎臟組織的代謝組學分析方法多采用單一的C18色譜柱進行色譜分離和分析，易造成強極性代謝物信息的缺失。因此，亟需建立一種對腎臟組織中小分子代謝物進行全面分析的代謝組學分析方法。

本研究以高靈敏、高分辨的液相色譜-質譜(LC-MS)技術為分析手段，采用甲基叔丁基醚/甲醇/水溶劑體系對大鼠腎臟組織中的代謝物進行提取，采用HILIC親水色譜柱和反相C18色譜柱相結合的色譜分離系統對代謝物進行分離，并以10種代表性代謝物為研究對象，優化建立了適用于大鼠腎臟組織中小分子代謝物全面分析的代謝組學分析方法。該方法可同時獲取腎臟組織中強極性和弱極性代謝物信息，具有靈敏度高、專屬性強、穩定性好等特點，適用于腎臟疾病和藥物腎毒性生物標志物的發現等研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜(Ultramate 3000)、Q-OT-qIT雜合型質譜儀(Orbitrap Fusion Lumos)、移液器(美國Thermo Fisher Scientific公司)；冷凍干燥機與真空離心濃縮儀(德國Christ公司)；離心機、混勻儀、渦旋儀(德國Eppendorf公司)；高速分散機(德國IKA公司)；0.22 μm濾膜(美國Agilent公司)。

牛磺酸(Taurine)、肌酸(Creatine)、L-異亮氨酸(L-Isoleucine)、1-甲基鳥嘌呤(1-Methylguanine)、5-甲硫腺苷(5-Methylthioadenosine)；溶血磷脂酰膽堿：LysoPC(14∶0)、LysoPC(16∶0)、LysoPC(17∶0)、LysoPC(18∶0)、LysoPC(18∶2)標準品購于美國Sigma-Aldrich公司。乙腈、甲醇(德國Merck公司)；甲酸(美國ROE公司)；甲基叔丁基醚(MTBE，美國J.T.Baker公司)；乙酸銨(美國Sigma-Aldrich公司)；二氯甲烷(美國Mreda公司)。所有試劑均為色譜純；實驗用水為某品牌純凈水。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集與制備取SD大鼠腎臟，用生理鹽水清洗表面血跡后立即置于液氮中冷凍保存，使用研缽在液氮中研磨成粉，粉末置于冷凍干燥機48 h。取凍干后的腎臟組織10 mg置于離心管中，加入400 μL預凍的冷溶劑(75%甲醇水)，用高速分散機勻漿3 min(25 000 r/min，1 min；3 000 r/min，1 min；25 000 r/min，1 min)。超聲10 min后加入1 mL甲基叔丁基醚，渦旋提取10 min(2 000 r/min)后，將樣品置于4 ℃冰箱20 min，于4 ℃離心15 min(15 000 r/min)，將上清液與蛋白和細胞沉淀物分離。上清液分為兩層：甲基叔丁基醚/甲醇層(上層：弱極性代謝物)和甲醇/水層(下層：強極性代謝物)，分別置于真空濃縮儀中濃縮至干，干燥時間分別約為2 h和1.5 h。取甲醇/水層干燥物用乙腈/水(80∶20，體積比)復溶至200 μL后離心、過濾，待分析；甲基叔丁基醚/甲醇層干燥物用乙腈/水(40∶60,體積比)復溶至120 μL后離心、過濾，待分析。

1.2.2 色譜條件強極性部分：采用Kinetex HILIC色譜柱(2.1 mm×150 mm，2.6 μm；Phenomenex公司)；流動相為乙腈(A)和水(含5 mmol/L乙酸銨，B)；流速為0.3 mL/min，進樣量為10 μL，柱溫為45 ℃。采用線性梯度洗脫：每次進樣前用初始流動相平衡8 min，0～25 min，5%～40%B；25～30 min，40%～5%B。

弱極性部分：采用ACQUITY UPLC CSH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm；Waters公司)；流動相為水(含0.1%甲酸，A)和乙腈(B)；流速為0.25 mL/min，進樣量為10 μL，柱溫為40 ℃。采用線性梯度洗脫程序：每次進樣前用初始流動相平衡5 min，0～2.5 min，2%～60%B;2.5～8 min，60%B;8～10 min,60%～81%B;10～18 min,81%～100%B;18～24.9 min，100%B;24.9～25 min，100%～2%B。

1.2.3 質譜條件強極性部分：離子源為電噴霧(ESI)源；采用正、負離子檢測模式；掃描模式為全掃描；掃描范圍：m/z100～1 000；質量分辨率：120 000；噴霧電壓：3.8 kV(正離子模式)，-3.0 kV(負離子模式)；鞘氣：0.20 MPa；輔助氣：0.10 MPa；離子源溫度：350 ℃(正離子模式)，380 ℃(負離子模式)；離子傳輸管溫度:350 ℃。

弱極性部分：采用ESI源，正、負離子檢測模式；掃描模式為全掃描；掃描范圍：m/z100～1 000；質量分辨率：120 000；噴霧電壓：3.8 kV(正離子模式)，-3.0 kV(負離子模式)；鞘氣:0.40 MPa；輔助氣：0.20 MPa；離子源溫度：350 ℃(正離子模式)，380 ℃(負離子模式)；離子傳輸管溫度:380 ℃。

1.2.4 數據處理獲得正、負離子檢測模式下的LC-(±)ESI-MS譜后，采用數據格式轉換軟件MSConvert將原始數據(.raw格式)轉換成為mzXML格式文件，并導入數據處理軟件XCMS進行峰識別、峰對齊、峰填充及峰過濾，最終獲得包括質荷比(m/z)、保留時間(Retention time)及其峰面積的二維數據陣。將上述二維數據陣導入SIMCA-P進行主成分分析(PCA)。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理方法的優化

代謝組學的樣品前處理步驟對最終實驗結果至關重要[10-11]，提取代謝組信息時應盡可能兼顧代謝物不同的理化性質，最大程度地獲得生物樣本中包含的所有代謝物信息，保持代謝組的原始性和完整性，同時去除雜質，使待測物與分析技術相匹配，提高檢測靈敏度。提取溶劑的種類、超聲時間、提取時間等參數均會對實驗結果產生影響，因此本研究對上述參數進行了優化。

2.1.1 提取溶劑的選擇在文獻調查的基礎上[12-17]，本研究以色譜峰數目、代表性代謝物的峰面積以及提取平行性為指標，比較了二氯甲烷/甲醇/水(28∶41∶42，體積比)、MTBE/二氯甲烷/甲醇/水(63∶36∶30∶35，體積比)、MTBE/甲醇/水(100∶30∶35，體積比)作為提取溶劑時對腎臟組織中代謝物的提取效果。

圖1 不同溶劑提取獲得的色譜峰數目比較

首先，將正、負離子檢測模式下獲得的LC-MS原始譜圖數據經格式轉化及XCMS軟件進行預處理，得到不同溶劑體系提取檢測到的色譜峰數目(如圖1)。結果顯示，MTBE/甲醇/水溶劑體系提取得到的色譜峰數目最多(共得到13 556個色譜峰,其中強極性部分6 956個，弱極性部分6 600個)，其次是MTBE/二氯甲烷/甲醇/水溶劑體系(共得到11 125個色譜峰，其中強極性部分6 890個，弱極性部分4 235個)，二氯甲烷/甲醇/水溶劑體系提取得到的色譜峰數目最少(共得到10 152個色譜峰，其中強極性部分5 773個，弱極性部分4 379個)。

隨后對不同提取溶劑體系獲得的10種代表性代謝物的提取離子流色譜峰面積進行了比較，結果如圖2所示。由圖2可知，MTBE/甲醇/水溶劑體系對腎臟中LysoPC(14∶0)、LysoPC(16∶0)、LysoPC(17∶0)、LysoPC(18∶2)和LysoPC(18∶0)等弱極性代謝物的提取效果顯著優于其他兩種溶劑體系，對L-異亮氨酸、牛磺酸、肌酸、1-甲基鳥嘌呤和5-甲硫腺苷等強極性代謝物的提取效果也最優，但與其他兩種溶劑體系的差別較小。

進一步計算了各代表性代謝物提取離子流色譜峰面積的相對標準偏差(RSD)，考察了不同提取溶劑體系的提取平行性，結果見表1。從表中可以看出，MTBE/甲醇/水溶劑體系提取得到的各代謝物色譜峰面積的RSD最小，大部分代謝物的RSD值小于15%，表明該溶劑體系對腎臟中代謝物的提取平行性最好。

綜上所述，本研究最終選擇MTBE/甲醇/水(100∶30∶35)作為提取溶劑。

表1 不同溶劑提取物LC-(+)ESI-MS分析獲得的代表性代謝物色譜峰面積的相對標準偏差

2.1.2 組織勻漿對提取效果的影響通過比較不勻漿與勻漿3 min條件下所獲得的色譜峰數目，考察了組織勻漿對于代謝物提取效率的影響。結果顯示，組織勻漿條件下，強極性部分和弱極性部分檢測到的色譜峰數目均顯著高于不勻漿條件下獲得的結果。上述結果表明，組織勻漿可顯著提高代謝物的提取效率。因此本實驗采用高速分散機對腎臟組織粉末勻漿后再進行溶劑提取，并選擇在冰浴條件下進行組織勻漿以防止提取液溫度過高對代謝物造成破壞，具體程序如“1.2.1”所示。

2.1.3 超聲時間的選擇以提取到的色譜峰數目為指標，考察了不同超聲時間(0、5、10、20 min)對代謝物提取效果的影響。結果表明，超聲0、5、10、20 min時，強極性部分可分別提取5 976、6 419、6 313和6 376個色譜峰，弱極性部分可分別提取5 391、5 619、6 132和6 272個色譜峰，共可分別提取11 367、12 038、12 445和12 648個色譜峰，表明超聲20 min提取的色譜峰數目最多，但與10 min差別不明顯。為避免超聲時間過長產生熱量而導致代謝物信息發生改變，最終選擇超聲提取時間為10 min。

2.1.4 渦旋提取時間的選擇本研究在代謝物提取過程中采用渦旋進行輔助提取，并比較了不同渦旋時間(5、10、20 min)獲得的色譜峰數目。結果表明，渦旋提取5、10和20 min時，強極性部分可分別提取5 594、6 257和6 357個色譜峰，弱極性部分可分別提取5 349、5 541和6 339個色譜峰，共可分別提取10 943、11 798和12 696個色譜峰。綜合考慮，最終選擇渦旋時間為20 min。

2.2 色譜與質譜條件的優化

2.2.1 色譜條件的優化強極性部分選用Kinetex HILIC色譜柱(2.1 mm×150 mm，2.6 μm)，弱極性部分選用ACQUITY UPLC CSH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，分別考察了進樣體積、流速、梯度洗脫程序、柱溫等對色譜分離效果的影響。優化后的總離子流色譜圖(TIC)如圖3所示，強極性部分在進樣量為10 μL，流速為0.30 mL/min，梯度洗脫時間為30 min，柱溫為45 ℃的條件下，各色譜峰的分離效果良好；弱極性部分在進樣量為10 μL，流速為0.25 mL/min，梯度洗脫時間為25 min，柱溫為40 ℃的條件下，各色譜峰的分離效果良好。

圖3 LC-(+) ESI-MS分析獲得腎臟代謝物的總離子流色譜圖

2.2.2 質譜條件的優化樣品測試前，采用質譜校正液將質譜的質量精度校正在2個ppm以內。選擇牛磺酸、肌酸、L-異亮氨酸、1-甲基鳥嘌呤、5-甲硫腺苷、LysoPC(14∶0)、LysoPC(16∶0)、 LysoPC(17∶0)、LysoPC(18∶0)和LysoPC(18∶2)10種對照品的混合溶液，采用蠕動泵直接進樣分析，對離子源噴霧電壓、鞘氣、輔助氣體、離子源溫度、離子傳輸管溫度等質譜參數進行了優化，以獲得最大的質譜響應和檢測靈敏度。

圖4 腎臟提取物在不同質量分辨率條件下經LC-(±)ESI-MS檢測到的色譜峰數目

此外，本研究發現質譜的質量分辨率對方法的靈敏度和特異性有顯著影響[18]。腎臟提取物在不同質量分辨率條件下(15 000、30 000、60 000、120 000和240 000)進行LC-(±) ESI-MS分析檢測到的色譜峰數目如圖4所示。結果顯示，當質量分辨率從15 000增至120 000時，測得的色譜峰數目逐漸增多。推測可能是由于隨著質量分辨率的提高，色譜未完全分離的分子量相近的共流出物在質譜中獲得了分離。圖5為腎臟提取物弱極性部分在LC-(+) ESI-MS檢測模式下保留時間為8.26 min時共流出物的質譜圖，由圖可知，質量數相差0.03 Da的共流出物在質量分辨率為15 000的條件下無法實現質譜分離，隨著質量分辨率的提高，其分離情況顯著改善，從而可提高其檢測的特異性、信噪比和靈敏度。但當分辨率從120 000增至240 000時，測得的色譜峰數目有所降低，推測可能與Orbitrap型高分辨質譜儀的掃描速度會隨著質量分辨率的增加而降低有關。綜合考慮特異性和靈敏度，選擇質譜分辨率為120 000。最終優化的質譜條件如“1.2.3”所示。

圖5 腎臟提取物弱極性部分在LC-(+) ESI-MS檢測模式下保留時間為8.26 min時共流出物的質譜圖

2.3 方法學評價

2.3.1 儀器精密度取大鼠腎臟的凍干粉末，按“1.2.1”方法進行提取，對同一樣品連續進樣6次進行分析，分別計算10種代表性代謝物色譜保留時間和提取離子流色譜峰面積的RSD，對儀器精密度進行考察。結果顯示，各代謝物提取離子流色譜峰面積的RSD均小于10%(表2)。此外，各代謝物保留時間的RSD值小于5.0%。上述結果表明儀器的精密度良好。

2.3.2 方法精密度取大鼠腎臟的凍干粉末，按“1.2.1”方法進行提取，平行制備QC樣本，每天進行6樣本分析，連續測定3天，將獲得的數據進行PCA分析，同時計算不同極性的內源性代謝物提取離子流色譜峰面積的RSD值，以評估方法的批內和批間精密度。經PCA分析后各樣本在第一主成分上的投影結果如圖6所示，18個QC樣本的偏差均在2SD范圍內。各代謝物提取離子流色譜峰面積的批內和批間RSD均不大于15%(表2)，此外保留時間的批內和批間RSD小于15%。上述結果表明，所建立的方法具有良好的重復性，從而可保證測試樣本間的差異主要來源于不同處理組樣品中內源性代謝物的差異，而不是由分析方法的誤差產生，因此本方法可用于腎臟代謝組學研究。

表2 LC-(±) ESI-MS方法的儀器精密度和方法精密度

3 結 論

本研究建立了基于液相色譜-超高分辨質譜技術的腎臟代謝組學分析方法。該方法以MTBE/甲醇/水溶劑體系作為提取溶劑，采用親水色譜和反相色譜相結合的色譜分離系統對代謝物進行分離，可同時獲取腎臟組織中的強極性和弱極性代謝物信息。方法學考察結果表明，該方法具有靈敏度高、專屬性強和穩定性好等特點，可為腎臟疾病和藥物腎毒性生物標志物的發現提供一種新方法。目前，該方法已應用于藥物腎毒性代謝組學研究中。