基于納升電噴霧-軌道阱超高分辨質(zhì)譜對完整單克隆抗體藥物進行分子量測定及糖型鑒定的條件探究

代榮榮，馬 鑫，邵心陽，柴胡玲瀟，王冠博*

(1.南京師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.北京諾和諾德醫(yī)藥科技有限公司，北京 102206；3.北京大學(xué) 前沿交叉學(xué)科研究院，北京 100871；4.深圳灣實驗室 細胞分析研究所，廣東 深圳 518055)

單克隆抗體(mAb)藥物由于其結(jié)合特異性、靶點多樣性、設(shè)計定向性等特點，近年來在研發(fā)投入、審批數(shù)量和市場規(guī)模等方面發(fā)展迅速[1]。mAb作為一類蛋白質(zhì)，不僅具有分子量大、結(jié)構(gòu)層次復(fù)雜的特點，還在翻譯后修飾(PTMs)等因素的作用下，呈現(xiàn)一定程度的固有結(jié)構(gòu)微異質(zhì)性[2-5]。在多種PTM中，糖基化不僅是微異質(zhì)性的重要貢獻者，更對mAbs的構(gòu)象、半衰期、功效和安全性等方面產(chǎn)生重要影響[6-8]。對mAb進行分子量測定并鑒定共存的糖型，對mAb的設(shè)計、生產(chǎn)和臨床使用均至關(guān)重要。

質(zhì)譜(MS)技術(shù)當(dāng)前已被廣泛用于mAb的分子量及糖型分析。在酶解所得的游離糖基鏈層面、糖肽層面和完整mAb層面進行糖型分析各具優(yōu)缺點[9-13]，其中在完整mAb層面進行糖型分布剖繪引入的樣品前處理最少，操作最為便捷，理論上具有更高的測定通量。此外，由于無需對碎片信息進行拼合，該方式獲得的分子量信息更加直接，所得糖型分布更能反映藥物分子層面的實際情況，在無需分析糖基鏈結(jié)構(gòu)的情況下，堪為首選策略。既有研究表明，利用納升電噴霧(Nanospray)離子化方式和超高分辨質(zhì)譜儀器，在低流速下測定完整mAb可獲得較理想的分子量和糖型數(shù)據(jù)[14-15]。然而，由于對完整糖蛋白的測定涉及高分辨儀器及相對復(fù)雜的參數(shù)設(shè)置，分子量及糖型測定結(jié)果可因多種儀器設(shè)置、操作參數(shù)及溶液條件的影響而產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果。為保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，需對相關(guān)條件的影響進行深入研究，并在測定中對實驗條件進行細致優(yōu)化。

本文以經(jīng)過完善質(zhì)量控制的mAb為標(biāo)準(zhǔn)樣品，以具有完整大型蛋白分子測定能力的超高分辨質(zhì)譜為工具，考察了低流速進樣模式下，儀器分辨率、源內(nèi)裂解、碰撞誘導(dǎo)碎裂、溶液組成等條件對分子量及糖型測定結(jié)果的影響，以期獲得優(yōu)化的完整mAb分子測定方案，助力于mAb的表征和相關(guān)研究。

1 實驗部分

1.1 材料試劑

單克隆抗體(mAb)樣品由北京諾和諾德醫(yī)藥科技有限公司提供；乙酸銨(NH4Ac)、甲酸、甲醇均為色譜純，購自美國Thermo Fisher Scientific。

1.2 儀器設(shè)備

Q Exactive UHMR Hybrid Quadrupole-Orbitrap質(zhì)譜儀，配商品化靜態(tài)納升電噴霧離子源(德國Thermo Fisher Scientific)；NanoDrop 2000紫外可見吸光光度儀(美國Thermo Fisher Scientific)。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理取適量mAb原液置于分子量截斷值為50 kDa的超濾管(美國Milipore)中，在4 ℃下離心超濾，補入150 mmol/L NH4Ac溶液進行鹽溶液置換，得樣品濃溶液。非變性樣品、變性樣品分別以150 mmol/L NH4Ac水溶液、含體積分?jǐn)?shù)75%甲醇及0.5%甲酸的水溶液稀釋至2 μmol/L。溶液濃度測定利用波長為280 nm的紫外光吸收實現(xiàn)。

1.3.2 質(zhì)譜分析取2～2.5 μL樣品溶液注入靜態(tài)噴針(德國Thermo Fisher Scientific)進行納升電噴霧離子化進樣。除正文提及的變量參數(shù)外，主要參數(shù)如下：microscan：5，maximum injection time：100 ms，desolvation voltage：-10 V。如無特殊說明，折合m/z400處的分辨率均設(shè)為50 000。二級質(zhì)譜(MS2)分析中母離子選擇寬度為100 Th。數(shù)據(jù)圖中每個質(zhì)譜圖均為80幀原始譜圖積累所得。數(shù)據(jù)采集過程中保持噴霧電壓和噴針位置不變，避免其對分析物價態(tài)分布的影響。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理去卷積化分析利用BioPharma Finder 3.1(Thermo Fisher公司)軟件進行，采用isotopic profile模式輸出分子量分布；糖型鑒定采用既往工作[16]中所述方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 源內(nèi)碎裂的影響

源內(nèi)碎裂(In-source fragmentation)可通過樣品離子與空氣分子的碰撞改善去溶劑化性能，減少加合物，提高分子量測定的準(zhǔn)確度。如源內(nèi)碎裂不充分，可能產(chǎn)生較多加合物信號及非特異性寡聚體信號[17]；而源內(nèi)碎裂過強，則可能導(dǎo)致樣品分子自身發(fā)生共價鍵斷裂。在對mAb的測定中，關(guān)閉源內(nèi)碎裂所得譜圖中除mAb單體外，可見少量非特異性結(jié)合的二聚體及三聚體存在；開啟源內(nèi)碎裂，則隨著能量加強，非特異性寡聚體豐度減少甚至消失(圖1A)，mAb單體的平均價態(tài)略有升高，各價態(tài)對應(yīng)的m/z分布呈現(xiàn)如圖1B所示的變化：未開啟源內(nèi)碎裂時m/z分布較寬，可見較多未完全分離的信號峰；隨著碎裂電壓升至150 V，m/z分布趨于簡化，3個主要信號峰中相鄰2個所對應(yīng)的分子量差異均為162 Da，為六碳糖殘基對應(yīng)的分子量。依據(jù)mAb糖基鏈的結(jié)構(gòu)特點，此圖說明相應(yīng)3個糖型中相鄰2個相差1個半乳糖殘基。依據(jù)信號的相對強度關(guān)系，可定量解析相應(yīng)糖型的相對豐度關(guān)系。在此3個信號峰右側(cè)相差35～38 Da處可見加合物信號峰，且隨碎裂能量增大而逐漸減弱；開啟源內(nèi)碎裂且碎裂電壓升至150 V前，低豐度信號峰圖無明顯變化，表明在此條件區(qū)間內(nèi)鑒定低豐度糖型較為可靠。碎裂電壓升至200 V后，主要信號峰有明顯展寬，對應(yīng)的平均分子量均減小，表明發(fā)生了較大程度的中性丟失，分子量測定值已不可靠；在低m/z區(qū)可見大量碎片離子峰，同樣表明在極端的源內(nèi)碎裂條件下mAb自身發(fā)生碎裂。

2.2 儀器分辨能力的影響

儀器分辨能力及分辨率設(shè)定值直接影響譜圖的分辨率以及分子量接近的糖型是否能被明確區(qū)分。可利用可能存在的殘基間的分子量數(shù)值，通過計算獲得區(qū)分不同糖型所需的最低分辨率。如表1所示，己糖及脫氧己糖分子量之差為16 Da；若2個mAb分子之間1條糖基鏈等同而另1條糖基鏈分別為G2及G1F，則在完整mAb層面至少需要約9 400的譜圖分辨率方能區(qū)分兩種分子。由于儀器操作界面中可調(diào)節(jié)的分辨率數(shù)值僅為針對低m/z的等效參考值，因此需根據(jù)儀器在高m/z區(qū)域的實際分辨性能調(diào)節(jié)分辨率設(shè)定值。

表1 幾種代表性單糖殘基的分子量差異

*relative to theMWof an intact mAb(approximately 150 kDa)

圖2 +22價mAb離子在不同標(biāo)稱分辨率(m/z 400等效)下的非變性質(zhì)譜信號分辨情況

針對此mAb樣品，考察了m/z400處等效標(biāo)稱分辨率設(shè)定值為3 125～50 000范圍的信號分辨情況(源內(nèi)碎裂電壓調(diào)至150 V，圖2)。結(jié)果顯示，僅當(dāng)標(biāo)稱分辨率達到50 000時，主要糖型峰及其鄰近的加合物峰(分子量差值測定值為35～38 Da)可被分辨；標(biāo)稱分辨率為12 500時，大量低豐度糖型難以檢測；標(biāo)稱分辨率降至3 125時，高豐度糖型也無法區(qū)分，譜圖中僅能通過峰值處對應(yīng)的m/z計算最高豐度糖型對應(yīng)的平均分子量。

圖3 +23價mAb離子在不同碰撞能量下的m/z圖(HCD模式)

圖4 變性條件對完整mAb譜圖的影響

2.3 碰撞誘導(dǎo)碎裂的影響

在質(zhì)譜質(zhì)量分析器內(nèi)部發(fā)生的碰撞誘導(dǎo)碎裂(CID)可起到進一步去除加合物的作用，但因其多為多級質(zhì)譜分析所采用，碰撞能量可調(diào)上限較高，在可調(diào)節(jié)區(qū)間內(nèi)更容易造成分析物自身的碎裂。由于唾液酸等單糖殘基容易在碰撞中丟失，碰撞也會造成糖型鑒定失真。本實驗所用儀器通過高能碰撞解離(HCD)實現(xiàn)碰撞。如圖3所示，當(dāng)使用N2作為碰撞氣時，5%的碰撞能量有效消除了加合物而未引起其它明顯變化，虛線框中所示的低豐度糖型信號未受影響；10%的碰撞能量造成了明顯的中性丟失，使主要糖型信號峰對應(yīng)的平均分子量減少70 Da左右，同時由于基線升高，使得低豐度糖型信號被掩蓋。如使用Xe作為碰撞氣，5%左右的碰撞即造成了更大程度的中性丟失，使得最高豐度分子量減小300 Da以上。

2.4 溶液條件的影響

對完整mAb的測定在多種情況下需使用含有機溶劑或酸的變性條件，如與液相分離手段的在線/離線聯(lián)用[18]、對mAb的穩(wěn)定性研究[19]等。盡管在常規(guī)ESI等高流速條件下有機溶劑或酸的存在可一定程度上提高信號響應(yīng)，但由于二者可顯著改變?nèi)芤吼ざ鹊攘黧w性質(zhì)，在低流速下進樣時，需對最適條件進行更加細致的優(yōu)化。本研究使用含體積分?jǐn)?shù)75%甲醇和0.5%甲酸的水溶液配制變性條件樣品溶液，采用源內(nèi)碎裂150 V、標(biāo)稱分辨率50 000、HCD模式關(guān)閉的條件采集數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖4所示。此條件下mAb的價態(tài)呈現(xiàn)二重分布，高價態(tài)分布中豐度最高的價態(tài)為+36，表明mAb發(fā)生了顯著的去折疊；低豐度分布的平均價態(tài)及分布寬度較非變性譜圖也明顯增加(圖4A)。分別取低、高價態(tài)分布中的單一價態(tài)圖樣(圖4B及圖4C)觀察，仍可見主要糖型的信號峰，但由于基線顯著升高且出現(xiàn)了大量加合物信號峰，主要糖型的信號分辨率及相對強度都受到很大影響。

圖5 多種條件下完整mAb質(zhì)譜數(shù)據(jù)的去卷積化結(jié)果比較

2.5 去卷積化結(jié)果所受的影響

將上述條件下所得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行去卷積化處理，可得完整蛋白分子量分布圖(圖5)。在非變性條件(Native condition)的測定中，理想條件下(Optimal)，主要糖型對應(yīng)的峰(圖5中豎直實線所示)得到明顯分離，可利用各自的峰面積進行糖型分布的相對定量，低豐度糖型對應(yīng)的峰清晰且可分辨；在低源內(nèi)碎裂等情況下的去溶劑化不良條件下(Suboptimal desolvation)，可見主要糖型對應(yīng)的峰，但由于大量其它相鄰信號峰的存在，分辨率及定量準(zhǔn)確度都會受到很大影響。這些其它信號峰中既包含溶劑及鹽離子參與形成的加合物峰[20]，也可能包含真實存在且在氣相中易碎的糖型所對應(yīng)的信號峰。圖5中點劃線及等距虛線所示的3組信號峰均與左側(cè)相鄰的主要糖型信號峰對應(yīng)分子量相差較為固定的數(shù)值((61±1)Da及(127±4) Da)，可能由含有唾液酸等易掉落殘基的糖型所產(chǎn)生。即使這些信號峰確由相關(guān)糖型引起，對其進行保留的意義依然有限，原因包括：(1) 相關(guān)糖型對氣相碰撞條件極為敏感，碎裂程度難以精確控制；(2) 相應(yīng)信號易與加合物信號及其它穩(wěn)定糖型信號重疊，影響譜圖分辨效果，進而影響糖型鑒定和定量；(3) 唾液酸殘基與己糖殘基的分子量差值(129 Da)與C-端賴氨酸剪切(在mAb骨架上經(jīng)常發(fā)生)所造成的分子量差值(128 Da)相近，極易造成對蛋白型的錯誤歸屬。因此，適當(dāng)增強碎裂效果，使唾液酸殘基掉落，保持剩余糖型在較寬條件范圍內(nèi)分布穩(wěn)定，可能為糖型鑒定帶來更大收益。如需測定含唾液酸糖型的含量，可由衍生化等方式進行處理，提高相應(yīng)糖型的穩(wěn)定性后實現(xiàn)[21]。在源內(nèi)碎裂程度極高或發(fā)生程度較高的CID等情況下，mAb分子因發(fā)生自身碎裂并丟失電中性碎片(Neutral loss)，質(zhì)譜圖發(fā)生扭曲，且低豐度糖型信號被掩蓋，同樣會增加大量的假陽性糖型鑒定結(jié)果。在非變性條件下(Denaturing condition)，若無法在數(shù)據(jù)采集階段達到最佳的去溶劑化效果，無論通過高價態(tài)分布還是低價態(tài)分布信號進行去卷積，所得結(jié)果均為基線較高、結(jié)合物種類較多且豐度較高、分辨率較低的質(zhì)量分布，難以進行準(zhǔn)確的糖型鑒定。這也表明在通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用或毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用等方式測定完整mAb分子量時，需在參數(shù)優(yōu)化上付出更多的努力，以減小去溶劑化不良帶來的影響。

3 結(jié) 論

使用質(zhì)譜手段對完整mAb藥物分子量測定和糖型鑒定時，在低流速下進樣(如使用納升電噴霧離子化)可節(jié)約樣品并獲得較高的離子化效率。非變性質(zhì)譜測定可在較寬的條件范圍內(nèi)獲得穩(wěn)定的分析結(jié)果；而在常規(guī)電噴霧離子化進樣中對信號響應(yīng)有提升作用的變性條件(含有機溶劑或酸)反而易對數(shù)據(jù)質(zhì)量產(chǎn)生不利影響，需針對去溶劑化性能進行細致的條件優(yōu)化以減少加合物的干擾。在變性條件下測定時，為確保分子量及糖型分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，理想情況下需與非變性條件下所得結(jié)果或其它分析方法所得結(jié)果相比較，進行方法驗證；在非變性條件下，源內(nèi)碎裂程度、儀器分辨率、CID、溶劑條件等均會對測定結(jié)果產(chǎn)生顯著影響，需根據(jù)這些參數(shù)的影響程度、條件控制難易及相應(yīng)的結(jié)果收益進行綜合評價，選擇合適的參數(shù)。根據(jù)本項工作的實驗結(jié)果，為保證測定數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠，建議使用中等強度的源內(nèi)碎裂參數(shù)，提升去溶劑化效果，減少溶劑/鹽加合物的形成，并避免發(fā)生mAb分子的共價鍵斷裂；建議使用具有高分辨能力的質(zhì)譜儀器，并調(diào)節(jié)設(shè)置使實際信號的譜圖分辨率達到4 000以上(實際分辨率受去溶劑化等條件的影響，難以通過低m/z區(qū)的標(biāo)稱分辨率進行直接換算)，以確保分子量相近的糖型得以分辨；若儀器具有CID功能，建議不開啟CID或僅在需要增強去溶劑化效果的情況下啟用最低能量的CID，避免mAb的碎裂。

致謝：本工作受到國家自然科學(xué)基金青年項目(21605085)及中國科協(xié)青年人才托舉工程項目(2017QNRC001)的資助。感謝北京諾和諾德醫(yī)藥科技有限公司提供樣品和抗體技術(shù)支持；感謝與該單位楊志茹博士及吳曉愛博士進行的有益討論。