微透析/液相色譜-質譜聯用篩選黃芩中α-葡萄糖苷酶抑制劑

龐 博，王倩倩，劉 舒，劉志強，宋鳳瑞，2*

(1.中國科學院長春應用化學研究所，長春質譜中心&吉林省中藥化學與質譜重點實驗室，吉林 長春 130022；2.中國科學技術大學 應用化學與工程學院，安徽 合肥 230026；3.南開大學 藥物化學生物學國家重點實驗室，天津 300457)

黃芩為我國著名傳統中藥，始載于《神農本草經》，為唇形科多年生草本植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根。中醫認為黃芩性寒味苦，具有清熱解毒、止血、安胎等功效，對濕熱痞滿、黃疸、癰腫瘡毒、肺熱咳嗽、高熱煩渴等有良好療效[1]。黃芩中含有多種活性成分，黃酮類化合物作為其中的主要成分，包括黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A等。隨著對黃芩藥理作用研究的不斷深入，發現黃芩具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤和保護心血管等作用[2-4]。此外，近期研究也發現黃芩具有較好的降血糖及治療糖尿病并發癥的作用[5-6]。α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20，α-Glucosidase)在生物體內分布廣泛，在機體的多種生理過程中起著關鍵作用，包括消化、糖蛋白合成、多糖及糖復合物的合成與分解等[7]。有文獻報道，α-葡萄糖苷酶與許多因代謝紊亂失調而引發的疾病(如糖尿病、肥胖癥、癌癥以及病毒感染等[8])密切相關。α-葡萄糖苷酶抑制劑則對該酶有很強的抑制作用，通過在小腸局部發揮作用，可有效延緩飲食中碳水化合物的吸收，使餐后血糖峰值低平，趨于穩定，從而降低血漿中的糖化血紅蛋白水平，發揮治療糖尿病的作用[9]。目前，已有α-葡萄糖苷酶抑制劑類化學藥物在臨床上用于治療糖尿病，而中藥資源豐富、高效低毒，具備篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑的天然優勢[10-11]。本研究以α-葡萄糖苷酶為生物靶點，利用微透析/液相色譜-質譜聯用技術，通過比較與生物靶分子結合前后溶液中處于游離狀態藥物濃度的變化來推斷藥物與靶分子之間的結合強度。同時，透析液可以無需任何前處理步驟直接進行液相色譜-質譜聯用分析。利用該方法從黃芩提取物中篩選出10種α-葡萄糖苷酶抑制劑，并對其結構進行了鑒定，為進一步研究黃芩治療糖尿病的作用機制、新藥研發，以及從其他中藥中篩選酶抑制劑提供科學依據。

1 實驗部分

1.1 樣品、試劑與儀器

α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20,Sigma,USA)；醋酸銨購于Sigma Chemical公司(St.Louis,MO,USA)；實驗用水為Milli-Q超純水；乙腈、乙酸(色譜級)購自美國Fisher公司；中藥材黃芩購自北京同仁堂長春藥店并經長春中醫藥大學王淑敏教授鑒定。黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品購于中國食品藥品檢定研究院，千層紙素A對照品購于上海融禾醫藥科技發展有限公司。

HX-200A型高速中藥粉碎機(浙江省永康市溪岸五金藥具廠)；微透析系統：灌注器推進泵(CMA 402 Syringe Pump)、灌注器(CMA 1.0 mL，MS-GAN100)、MAB85樣品自動收集器、取樣探針MAB 7.8.10(截留分子量15 kD,膜長10 mm)購自Microbiotech/se AB公司；Waters H-class液相色譜儀(美國Waters公司)；LTQ XL線性離子阱液相色譜-質譜聯用儀(美國Thermo Fisher公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃芩水提物的制備黃芩粉碎后稱取藥材粉末25 g，加入10倍體積水浸泡20 min，加熱回流提取45 min，過濾，殘渣在相同條件下提取30 min，合并2次提取液，旋轉蒸發濃縮至0.5 g/mL后冷凍干燥。所得黃芩提取物凍干粉末用甲醇溶解后制得生藥質量濃度為100 mg/mL的儲備液，過0.22 μm微孔濾膜，備用。

1.2.2 對照品溶液的制備分別精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A適量，用甲醇溶解并定容配成1.0 mg/mL對照品儲備液，再用甲醇稀釋各對照品儲備液制得質量濃度均為50 μg/mL的混合對照品溶液，備用。

1.2.3 微透析篩選方法在EP管中添加適量α-葡萄糖苷酶液、黃芩提取物溶液和10 mmol/L NH4Ac緩沖溶液(pH 6.8)，總反應體系為1.5 mL，黃芩提取物終濃度約為5 mg/mL，酶濃度約為10 U/mL，混勻后置于37 ℃水浴中反應30 min。然后將反應體系取出，插入探針，在1.0 μL/min流速下，以反應體系緩沖液(含10%甲醇)灌流，平衡90 min后采集樣品，每40 min采集一次，平行采集4個樣品后直接用于LC-MSn分析。以相同體積的10 mmol/L NH4AC緩沖液代替酶液作為空白對照組，空白對照組中其他溶液的加入量及處理、透析方法與上述相同。另外制備與空白對照組完全相同的樣品用于提取物中成分的回收率測定，該樣品不經過透析，直接進行LC-MSn分析。

1.2.4 色譜-質譜條件液相色譜條件：迪馬C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃；流動相為乙腈(A)-0.5%醋酸水溶液(B)，梯度洗脫程序：0～10 min，27%～35% A；10～20 min，35%～50% A；20～25 min，50%～60% A；25～30 min，60%～80% A；30～35 min，80%～100% A；進樣量10 μL。

質譜條件：電噴霧離子源，正離子檢測模式，掃描范圍為m/z100～1 000，噴霧電壓5.0 kV，毛細管溫度250 ℃，鞘氣流速(N2) 45 L/h，輔助氣流速90 L/h，金屬毛細管電壓32 V。

2 結果與討論

2.1 黃芩與α-葡萄糖苷酶的相互作用

圖1為黃芩提取物與α-葡萄糖苷酶相互作用以及不加酶的空白對照的液相色譜圖。由圖1可以看出在微透析篩選實驗條件下，黃芩提取物中僅部分化合物能夠與α-葡萄糖苷酶結合，通過比較峰面積的變化情況篩選出10種成分可以與α-葡萄糖苷酶產生相互作用(表1)。

2.2 黃芩中與α-葡萄糖苷酶結合的化合物結構鑒定

通過LC-MSn分析對黃芩提取物中10種潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑成分進行結構鑒定，其保留時間、色譜峰歸屬以及ESI-MSn數據見表1。

由表1可見，1號峰和2號峰的保留時間分別為3.91 min和4.36 min，兩者的一級全掃描質譜圖中均產生m/z549的準分子離子峰[M+H]+(圖2)，其分子量均為548，推測二者為一對同分異構體。再經二級及三級串聯質譜信息發現，二者均能產生m/z531、513、483、465等系列失水得到的碎片離子，但離子強度有所差異，結合文獻報道[12]，推測1號峰為白楊素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷，2號峰為白楊素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷，其結構見表2。

圖2 化合物1和2在正離子模式下的質譜圖

3號峰和4號峰的保留時間分別為8.52 min和10.76 min，其一級全掃描質譜圖中的準分子離子峰[M+H]+均為m/z447，推測二者為一對同分異構體。MS2質譜信息顯示，[M+H]+丟失分子量為176 Da的中性碎片，產生m/z271的碎片離子，推測176 Da的中性碎片可能為葡萄糖醛酸殘基；MS3質譜條件下進一步碎裂產生m/z253、225、169的碎片離子。根據與黃芩苷標準對照品的串聯質譜信息比對，并結合色譜保留時間，推定3號峰為黃芩苷，4號峰為漢黃芩素-5-O-葡萄糖苷，其結構見表2。

5號峰和6號峰的保留時間分別為11.31 min和13.00 min，在其一級全掃描質譜圖中[M+H]+均為m/z461，推測二者也為一對同分異構體。在MS2質譜信息中，二者的MS2均產生[M+H-176]+即m/z285的特征離子碎片，與丟失葡萄糖醛酸殘基相吻合；進一步進行MS3碎裂，發現二者均能產生丟失葡萄糖醛酸殘基和CH3基團的碎片離子m/z270，由此證明其結構中均含有甲氧基。結合保留時間、串聯質譜信息以及對比文獻報道[13-14]，推定5號峰為木蝴蝶素-7-O-葡萄糖醛酸苷，6號峰為漢黃芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷(漢黃芩苷)。7號峰對應的保留時間為19.14 min，一級全掃描質譜信息中[M+H]+為m/z271，其二級串聯質譜圖中m/z253、243、225的碎片離子分別為丟失一個H2O，一個CO，以及同時丟失一個H2O和一個CO產生的。這些碎片信息與黃芩素對照品的串聯質譜信息一致，因此推定7號峰為黃芩素。化合物5、6、7的結構見表2。

8號峰和10號峰的保留時間分別為25.26 min和26.71 min。一級全掃描質譜信息中的準分子離子峰[M+H]+均為m/z285，推測二者也為一對同分異構體，在二級串聯質譜圖中，二者均產生[M+H-CH3]+即m/z270的特征離子碎片，說明二者含有甲氧基。MS3碎裂發現二者所產生的碎片有明顯差異，根據保留時間、串聯質譜信息及文獻報道[15-16]，同時與漢黃芩素和千層紙素A的標準對照品的串聯質譜信息比對，推定8號峰為漢黃芩素，10號峰為千層紙素A，結構見表2。

9號峰的保留時間為25.81 min，其一級全掃描質譜圖中的準分子離子峰[M+H]+為m/z375，在MS2質譜信息中的m/z360和m/z345碎片離子分別為[M+H-CH3]+和[M+H-2CH3]+。通過與文獻報道結果對比[14]，推定其為黃芩黃酮Ⅱ，結構見表2。

表2 黃芩提取物中與α-葡萄糖苷酶結合化合物的結構

2.3 探針的回收率及黃芩提取物與α-葡萄糖苷酶的結合率

在灌流液為含10%甲醇的醋酸銨溶液，灌流速度為1.0 μL/min的微透析實驗條件下，以黃芩提取物在微透析前后色譜圖中各成分的峰面積之比計算其探針回收率。實際實驗過程中，探針膜的種類和長度、灌流速度、實驗溫度以及探針的幾何結構等因素均會對回收率產生影響。

由圖1可知，黃芩提取物中有10種成分可與α-葡萄糖苷酶產生相互作用。假設在不加入酶的對照組中藥物色譜峰積分面積為A，加入酶的實驗組中藥物色譜峰積分面積為B，則藥物與酶的結合強度可表示為：Binding Degree(%)=(A-B)/A×100，用此計算方法可對體系中的各組分與生物靶分子的相對結合強度進行比較，本研究計算的黃芩提取物中10種成分的探針回收率以及與α-葡萄糖苷酶相互作用的結合率見表3。結果顯示，黃芩提取物中篩選出的10種化合物與α-葡萄糖苷酶的結合率均不低于36.18%，表明黃芩提取物中的活性成分均與α-葡萄糖苷酶有良好的特異性結合。

表3 黃芩提取物中與α-葡萄糖苷酶結合化合物的探針回收率及結合率

3 結 論

本文以α-葡萄糖苷酶為生物靶點，通過微透析/液相色譜-質譜聯用技術從黃芩提取物中篩選出10種α-葡萄糖苷酶抑制劑。該篩選方法能夠保證藥物與靶分子的作用體系始終處于溶液狀態，可真實反映藥物與靶分子的相互作用，且能夠避免藥物與膜間的非特異性作用干擾。利用串聯質譜對篩選出的抑制劑進行結構鑒定，計算了此10種化合物與α-葡萄糖苷酶的結合率以及探針回收率。結果表明，黃芩中的黃酮類化合物均具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制作用，可為進一步研究黃芩治療糖尿病的藥理作用以及篩選高效的α-葡萄糖苷酶抑制劑研究提供依據。