在線固相萃取凈化-高效液相色譜法測定人血漿中的霉酚酸

許澤君，景 霞*，孫 芳，吉 超*，楊新磊

(1.南京醫科大學 附屬兒童醫院，江蘇 南京 210008；2.安捷倫科技(中國)有限公司，上海 200080 )

嗎替麥考酚酯(Mycophenolate mofetil,MMF)是一種腎移植時常用的免疫抑制劑[1]，在進入人體后快速水解成霉酚酸而發揮藥效[2]。近年來，該藥被發現在治療腎病綜合癥方面也有著良好的應用前景，并且由于其腎毒性較小，在兒科臨床上使用日益增多[3-5]。有研究表明，在固定劑量下，成人體內的藥物暴露量有很大差異，個體間藥代動力學差異甚至大于10 倍[6]，再加上該藥的服用療程較長，這種差異可能造成療效不足或者不良反應[1,3-5]。為保證合理用藥[7]，進行霉酚酸的血藥濃度監測十分必要。

酶放大免疫法(EMIT)[8-9]、高效液相色譜法(HPLC)[10-13]及液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[14-15]是常用的3種血藥濃度檢測手段。其中，酶放大免疫法快速方便，但特異性較差，代謝物會產生免疫交叉反應，導致結果正偏離[16]，且所用試劑盒較為昂貴。高效液相色譜法中，由于血漿含有大量的蛋白和磷脂等大分子雜質，需要對血樣進行復雜的前處理后才能進樣分析，造成時間、人力及試劑的消耗較大，且還會引入誤差。LC-MS/MS同樣涉及復雜的樣品前處理，且儀器采購與成本維護昂貴，對操作人員的要求較高。基于醫院臨床的大樣本和時效性等特點，傳統的液液萃取、離線固相萃取等方法由于其步驟繁瑣、重現性欠佳等局限性，不適用于醫院檢測。而在線固相萃取(Online SPE)是一種基于閥切換的自動化樣品前處理技術，具有分析快速、操作簡單、重現性好、易于聯用等優點。本方法使用限進介質填料的萃取柱,自動化去除經蛋白沉淀后樣品中的少量殘余蛋白與磷脂，以實現對目標物的富集與凈化。進一步將Online SPE與HPLC 聯用則可克服HPLC靈敏度不足、干擾較大的局限性，在臨床血藥濃度檢測領域具有良好的應用前景，已用于茶堿[17]、左旋舒必利[18]、氨磺必利[19]等藥物的血藥濃度監測。本文建立了Online SPE-HPLC聯用測定血漿中霉酚酸濃度的分析方法，減少了分析步驟和人為因素引入的誤差，節省了試劑消耗，可以滿足醫院臨床監測的需求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Online SPE-HPLC系統購自安捷倫公司，包括一維模塊(G7111A泵、G7167自動進樣器、G7167B柱溫箱和G7114A檢測器)和二維模塊(G7120A泵、G7117B 二極管陣列檢測器和G1170A雙二位四通閥)；十萬分之一分析天平(MS205DU，瑞士Mettler Toledo公司)；Vortex-5渦旋振蕩器(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司);Abbott離心機( 德國Hettich公司)。

霉酚酸標準品(純度大于98%,Lot.086M4010V,Sigma公司);甲醇、乙腈(色譜純，國藥集團化學試劑有限公司)；純化水采用二級反滲透裝置純水系統(南京慧城水處理設備有限公司)自制。空白血漿由南京醫科大學附屬兒童醫院提供。

1.2 樣本的制備

圖1 Online SPE系統連接示意圖

精密稱取霉酚酸標準品12.5 mg至25 mL容量瓶，加甲醇至刻度后，超聲2 min。置于-30 ℃冰箱內保存。用空白血漿稀釋至目標濃度后，取200 μL置于1.5 mL 離心管中，加入甲醇400 μL，渦旋振蕩5 min后，10 800 r/min離心8 min，取上清液，進樣檢測。

1.3 液相色譜與在線固相萃取條件

固相萃取柱：Capcell PAK MF Ph-1(4.6 mm×10 mm)；分析柱：Poroshell 120? EC-C18柱(4.6 mm×50 mm，2.7 μm)。1D泵流動相A為甲醇，流動相B為0.5%磷酸水溶液，梯度洗脫，流速為1.0 mL/min；2D泵流動相A為乙腈，流動相B為0.1%三乙胺溶液(10%磷酸調節pH至3.5±0.1)，流速為0.8 mL/min；柱溫30 ℃，檢測波長215 nm，進樣量20 μL。

Online SPE系統連接如圖1所示。實驗過程中，0～2.0 min，切換閥處于1～3連接狀態，1D泵將樣品上樣至固相萃取柱，樣品中的霉酚酸在固相萃取柱中保留，而蛋白等大分子物質不保留，直接流入廢液；2.0～2.5 min，切換閥處于1～7連接狀態，2D泵流動相將霉酚酸從固相萃取柱轉移至分析柱；2.5～9.0 min，切換閥處于1～3連接狀態，1D泵沖洗固相萃取柱并將流動相平衡至初始狀態，分析泵繼續完成霉酚酸的分離和沖洗平衡，具體洗脫程序和閥切換參數見表1。

表1 在線固相萃取、分析洗脫及閥切換的程序

2 結果與討論

2.1 樣品制備條件的優化

在線固相萃取雖可去除血漿中的蛋白，但將血漿直接進樣，會由于蛋白含量過高，影響萃取柱的壽命和方法的穩定性。因此在樣品制備過程中，先加入有機溶劑沉淀去除大部分蛋白，再進行固相萃取及分析。考察了常用有機蛋白沉淀試劑甲醇及乙腈對樣品中蛋白的去除效果，發現經乙腈處理后的樣品溶液經過長時間放置或者冷藏后會再次析出蛋白，可能會造成萃取小柱堵塞。因此實驗選擇甲醇作為最佳蛋白沉淀試劑。

此外，樣品制備時，樣品-甲醇的體積比也會影響血漿中蛋白沉淀的效率。隨著甲醇比例的增加，沉淀效率略有提高，但同時也會稀釋樣品中的霉酚酸濃度。考慮到在線固相萃取中還會進一步去除蛋白，為了保證方法的靈敏度，本實驗選擇樣品-甲醇的體積比為1∶2。

2.2 固相萃取條件的優化

固相萃取主要目的是純化樣品，在去除血漿中蛋白質等大分子的同時，保留藥物小分子。常規的反相色譜柱對大分子蛋白具有一定的保留作用，而高有機相比例會造成蛋白質析出，長期使用會導致柱頭堵塞，使用壽命縮短。限進介質色譜柱是近年發展起來的新型色譜柱，其通過尺寸排阻、鍵合長鏈親水基團等手段，達到降低大分子蛋白在柱內保留的效果，可有效去除樣品中殘余的蛋白，并保留小分子藥物。該類萃取柱的鍵合相類型較多，如反相C18、C8、苯基、離子交換等。不同的鍵合相具有不同的化合物選擇性。本實驗中，由于目標物霉酚酸具有苯環共軛結構，能與苯基柱中的苯環鍵合相產生Π-Π相互作用，從而形成較好的特異性吸附。此外，苯基柱的反相保留能力比C18弱，將霉酚酸從苯基柱上洗脫時有機相比例無需太高，進入C18分析柱時可再次產生柱頭富集效果，避免產生溶劑效應，使目標物峰形更加尖銳。綜上考慮，本實驗選擇苯基型的Capcell PAK MF Ph-1作為萃取柱。該柱不僅純化效果好，而且可重復使用千次以上[19]。

圖2 霉酚酸在1D檢測器的色譜圖(不切換)

由于固相萃取流動相的選擇會直接影響蛋白的去除效果及目標物的保留，本實驗中，目標物霉酚酸具有羧基及酚羥基兩個易電離基團，因此選擇在固相萃取的水相中加入0.5%磷酸，使流動相呈酸性，以抑制霉酚酸的電離，增強其在萃取柱上的保留，具體流動相選擇見“1.3”。實驗結果顯示，當流動相中甲醇比例為20%時，樣品中的蛋白可快速通過萃取柱，霉酚酸在固相萃取柱的保留時間可達3.7 min左右(見圖2)。因此，本實驗選擇2 min時切換閥，能保證蛋白質已完全洗脫去除，而霉酚酸仍保留在萃取柱中。在2.5 min閥切回時,1D檢測器未檢出霉酚酸的信號，表明霉酚酸均已進入分析柱(圖3)。

圖3 2～2.5 min閥切換時，1D()和2D()檢測器的色譜圖

2.3 分析條件的優化

2.3.1 流動相的優化比較了乙腈、甲醇作為有機相以及pH值不同(pH 3.5、6.5)的水相等不同流動相組成對霉酚酸峰形和響應的影響。結果表明，以乙腈為有機相時，霉酚酸的響應明顯高于甲醇；由于霉酚酸易電離，需要較低pH值產生抑制，因此選擇pH 3.5的水相時能得到更好的峰形；為了進一步提高峰形的對稱性，實驗選擇加入0.1%三乙胺抑制霉酚酸拖尾，并選擇了水相與有機相的比例為65∶35，以獲得適中的保留時間。

2.3.2 波長的優化對標準品進行全波長掃描，發現霉酚酸在215 nm 和254 nm附近均有較強的吸收光譜，且以215 nm處的響應更高，因此實驗選擇215 nm為最佳檢測波長。

2.4 分析方法的評價

2.4.1 專屬性在優化實驗條件下，分別處理空白血漿和含霉酚酸的血漿，進樣分析。結果顯示，霉酚酸在分析柱中的保留時間為5.7min，與空白血漿相比，無血漿內源性物質干擾，且峰形良好(圖4)。

圖4 空白血漿(A)和加標血漿樣品(B)的色譜圖

2.4.2 標準曲線、檢出限與定量下限以血漿為基質，配制霉酚酸質量濃度分別為0.20、0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00 μg/mL的系列基質加標樣品。以霉酚酸的峰面積(Y)和對照品質量濃度(X，μg/mL)作線性回歸，得到回歸方程為Y=58.16X+1.58，r=0.999 8。定量下限(S/N=10)為0.20 μg/mL，檢出限(S/N=3)為0.07 μg/mL。

2.4.3 回收率與相對標準偏差配制0.39、25.00、50.00 μg/mL高、中、低3 種霉酚酸質量濃度的血漿樣品，每種濃度1 d 內按“1.3”方法平行操作5次，連續測定3 d。根據標準曲線，考察對照品的加標回收率及日內、日間精密度。測得霉酚酸的日內回收率為98.0%～105%，日內相對標準偏差(Intra-RSD)為2.6%～3.1%，日間回收率為96.2%～104%，日間RSD(Inter-RSD)為2.9%～3.3%，方法的準確度與精密度均良好(表2)。

表2 血漿樣品中霉酚酸的回收率與相對標準偏差

2.4.4 方法的穩定性考察了含高、中、低3 種質量濃度(0.39、25.00、50.00 μg/mL)霉酚酸的血漿樣品在不同溫度條件下(室溫放置6 h、4 ℃冰箱放置12 h、反復凍融3次)的穩定性。結果顯示，霉酚酸在上述3種溫度條件下的RSD為1.3%～5.8%，表明霉酚酸在這3種條件下基本穩定(表3)。

表3 加標血漿樣品中霉酚酸的穩定性

表4 5例患者的霉酚酸測試結果

2.5 臨床應用

采集5例服用嗎替麥考酚酯的待測患者0、0.5、2.0 h后的血樣，高速離心后取血漿按本方法對霉酚酸的質量濃度進行檢測(C0 h、C0.5 h、C2.0 h)。結果顯示(見表4)，霉酚酸的質量濃度均在線性范圍內。通過有限采樣法可以計算霉酚酸在患者體內的暴露量(AUC0-12 h)[20]，以評價霉酚酸的吸收程度及其在體內的暴露特性，從而供臨床參考。

3 結 論

本研究建立了血漿中霉酚酸的在線樣品前處理-高效液相色譜分析方法。本方法樣本前處理簡便，分析過程高效快速，準確度和精密度良好，為臨床開展霉酚酸的血藥濃度監測提供了適宜的分析方法。