響應面法優化黃漿水發酵液制備工藝及其抗氧化活性研究

王珊珊，孫曉琦，馬玉潔，李娜，周德慶，2，*

（1.中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東青島266071；2.青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東青島266000）

豆腐作為一種常見的餐桌食物，距今已有近2 000 年的歷史。豆腐具有口感嫩滑、豆香濃郁、營養價值高、種類豐富且易于消化吸收等諸多優點，深受世界各國人民的歡迎[1]。一般豆腐的制作主要由浸泡、磨漿、過濾、煮漿、點腦、蹲腦、破腦、壓榨成型等幾個環節組成[2]。黃漿水是豆腐在壓榨成型時產生的乳清廢水，產量大，成分復雜，含有較多有益于人體的大豆異黃酮、蛋白質、皂苷、低聚糖等生物活性成分，具有較高的開發利用價值。據統計，每加工1 t 大豆可排放2 t～5 t 黃漿水[3-4]。由于豆制品加工廠大多規模較小，受加工工藝和設備的制約，大部分黃漿水被當成廢水簡單處理后排放，造成資源的極大浪費。

近年來，對大豆黃漿水進行綠色、經濟、高效的綜合利用開始引起人們的重視。張瑞等采用脫腥、酶解和配制方式進行新型黃漿水配制醬油的研制，所得產品在色澤、香氣和滋味上均與市面釀造產品無顯著性差異[5]；鄧麗華等采用正交試驗對黃漿水進行醋酸發酵制醋，在經過培養7 d 后即達到酸度＞3.5%[6]；李麗梅等采用脫臭、澄清、調配等工藝研制黃漿水紅棗復合飲料，制得的產品口感柔和、組織狀態均勻一致[7]。但目前利用乳酸菌發酵提高黃漿水抗氧化活性的研究報道相對較少。前期試驗表明，植物乳桿菌、清酒乳桿菌和嗜酸乳桿菌均可在黃漿水中生長產酸，3 種菌株組合發酵后黃漿水的抗氧化活性有顯著提高[8]。本試驗在前期研究基礎上，通過單因素試驗及響應面法對黃漿水發酵液制備工藝進行優化，為進一步開發黃漿水發酵飲料提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃漿水：青島三聚成有限公司；植物乳桿菌CICC 20265（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳桿菌 CICC 22162（Lactobacillus acidophilus）、清酒乳桿菌 CICC 6245（Lactobacillus sakei）：中國工業微生物菌種保藏中心；總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS 法）：南京建成生物工程研究所；MRS 培養基：北京陸橋技術股份有限公司；其它試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV1102Ⅱ紫外/可見分光光度計：上海天美科學儀器有限公司；HCB-1300V 垂直層流潔凈工作臺：青島海爾醫療有限公司；Neofuge 15R 高速冷凍離心機：力康生物醫療科技控股有限公司；FD5 真空冷凍干燥機：金西盟公司；RE-52AA 旋轉蒸發儀：上海亞榮儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵組合菌種的準備

將植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和清酒乳桿菌分別置于MRS 固體培養基上，于37 ℃條件下活化培養20 h，再以10%接種量接種于MRS 液體培養基。37 ℃培養20 h 后，4 000 r/min 離心5 min，用無菌生理鹽水洗滌乳酸菌兩次后制備菌懸液，使其濃度為8 log cfu/mL。將植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和清酒乳桿菌的菌懸液按照1 ∶1 ∶1 的體積比混合作為發酵組合菌種，接種量以待接種的黃漿水體積計算[9]。

1.3.2 黃漿水發酵液的制備

向100 mL 黃漿水中添加5%葡萄糖和5%脫脂奶粉，混勻后于115 ℃條件下滅菌10 min。然后在無菌條件下接入1%活化后的發酵組合菌種，37 ℃恒溫發酵，測定發酵液提取物的DPPH 自由基清除率。

1.3.3 提取物的制備

分別取100 mL 發酵前后的黃漿水，40 ℃下旋蒸濃縮至10 mL，加入100 mL 80%乙醇，超聲輔助提取40 min 后，離心（10 000 r/min，4 ℃，10 min）取上清液，40 ℃旋蒸濃縮后，真空冷凍干燥得到提取物。用80%乙醇配成不同濃度梯度的待測樣品液，用于抗氧化活性的測定。

1.3.4 DPPH 自由基清除率的測定

取2 mL 不同濃度梯度待測樣品液，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH·乙醇溶液，混勻后避光靜置30 min，于 517 nm 處測吸光值[10]。

DPPH 自由基清除率/%=[（1-（A樣液-A空白）/A對照）]×100

式中：A樣液為2 mL 待測樣品液與等體積DPPH·乙醇溶液混合反應后的吸光值；A空白為2 mL 待測樣品液與等體積無水乙醇混合后的吸光值；A對照為2 mL無水乙醇與等體積DPPH·乙醇溶液混合后的吸光值。

1.3.5 單因素試驗

固定發酵溫度37 ℃、發酵時間24 h、脫脂乳粉添加量5%、葡萄糖添加量5%、接種量1%為基本條件，以DPPH 自由基清除率為測定指標，進一步探究發酵溫度（28、31、34、37、40、43 ℃）、發酵時間（12、24、36、48、60、72 h）、脫脂乳粉添加量（1%、3%、5%、7%、9%、11%）、葡萄糖添加量（0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%）及接種量（0.5%、1%、2%、3%、4%、5%）對發酵液提取物DPPH 自由基清除率的影響。

1.3.6 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以DPPH 自由基清除率為指標，以發酵時間（A）、脫脂乳粉添加量（B）、葡萄糖添加量（C）三個因素為自變量，根據Box-Behnken 試驗設計原理，采用軟件Design-Expert V8.0.6.1 設計三因素三水平的響應面分析試驗，因素與水平設計如表1 所示。

表1 響應面優化試驗因素與水平Table 1 Factors and their coded values used in response surface analysis

1.3.7 對羥自由基清除率的測定

取1 mL 不同濃度的待測樣品液，依次加入0.5 mL 2 mmol/L EDTA-Fe2+溶液、1 mL 20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS，pH=7.4） 溶液、1 mL 360 μg/mL 番紅花 T 溶液、1 mL 3 %H2O2溶液，混勻，37 ℃水浴 30 min，于 520 nm 處測吸光值[11]。

羥自由基清除率/%=[（A樣液-A空白）/（A對照-A空白）]×100

式中：A樣液為待測樣液吸光值；A空白為 PBS 代替樣液做空白對照的吸光值A對照為PBS 代替樣液和H2O2的吸光值。

1.3.8 對ABTS 自由基清除率的測定

使用A015-2 試劑盒進行測定，具體操作方法與結果處理參見南京建成生物工程研究所相應說明書。

1.4 統計分析

每組試驗重復3 次，測試結果以平均值±標準偏差的形式表示；使用SPSS 20.0 軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 單因素驗試結果

2.1.1 發酵溫度對黃漿水發酵液DPPH 自由基清除率的影響

發酵溫度對黃漿水發酵液DPPH 自由基清除率的影響見圖1。

圖1 發酵溫度對黃漿水發酵液DPPH 自由基清除率的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on the DPPH radical scavenging rate

由圖1 可知，在28 ℃～43 ℃的發酵溫度范圍內，黃漿水發酵液的DPPH 自由基清除率變化幅度較小。當發酵溫度為37 ℃時，發酵液的DPPH 自由基清除率（72.67%）顯著高于其他發酵溫度（P＜0.05）。因此確定37 ℃為發酵黃漿水的最佳溫度。

2.1.2 發酵時間對黃漿水發酵液DPPH 自由基清除率的影響

發酵時間對黃漿水發酵液DPPH 自由基清除率的影響見圖2。

圖2 發酵時間對黃漿水發酵液DPPH 自由基清除率的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the DPPH radical scavenging rate

由圖2 可知，與未發酵黃漿水相比，發酵12 h 的黃漿水對DPPH 自由基的清除率從56.68 %升高到67.27%。此后隨著發酵時間的延長，發酵液的DPPH自由基清除率持續升高，直到第36 h 達到最高（74.32%）。這可能是由于發酵過程中復雜的大分子酚類物質被逐漸轉化為小分子游離酚類物質，小分子酚類物質易于給出H+，H+能夠與DPPH 自由基發生共振雜化生成穩定產物[12-13]。第36 h～第60 h 時發酵液的DPPH 自由基清除率開始降低，這可能是由于發酵液中的小分子游離酚類等抗氧化物質被乳酸菌進一步分解，降低了發酵液總體的抗氧化活性。因此，適宜的發酵時間為36 h。

2.1.3 脫脂乳粉添加量對黃漿水發酵液DPPH 自由基清除率的影響

脫脂乳粉添加量對黃漿水發酵液DPPH 自由基清除率的影響見圖3。

圖3 脫脂乳粉添加量對黃漿水發酵液DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of skimmed milk powder content on the DPPH radical scavenging rate

由圖3 可知，隨著脫脂乳粉添加量的增加，黃漿水發酵液對DPPH 自由基的清除率呈現上升趨勢，在脫脂乳粉添加量為7 %時，其DPPH 自由基清除率為75.38%。此后隨著脫脂乳粉的添加量繼續增加，發酵液的DPPH 自由基清除能力則有所降低。因此，適宜的脫脂乳粉添加量為7%。

2.1.4 葡萄糖添加量對黃漿水發酵液DPPH 自由基清除率的影響

葡萄糖添加量對黃漿水發酵液DPPH 自由基清除率的影響見圖4。

圖4 葡萄糖添加量對黃漿水發酵液DPPH 自由基清除率的影響Fig.4 Effect of glucose content on the DPPH radical scavenging rate

由圖4 可知，當葡萄糖添加量為0.5%～4%時，黃漿水發酵液的DPPH 自由基清除能力逐漸升高。當添加量為4%時，發酵液對DPPH 自由基的清除率達到最高（77.99%）。在此之后，黃漿水發酵液的抗氧化活性則逐步趨于穩定。因此，適宜的葡萄糖添加量為4%。

2.1.5 接種量對黃漿水發酵液DPPH 自由基清除率的影響

接種量對黃漿水發酵液DPPH 自由基清除率的影響見圖5。

圖5 接種量對黃漿水發酵液DPPH 自由基清除率的影響Fig.5 Effect of inoculum concentration on the DPPH radical scavenging rate

接種量的高低會影響發酵初期乳酸菌的生長速度，接種量過低時，乳酸菌生長的延滯期變長易導致雜菌污染，甚至發酵失敗；接種量過高時，乳酸菌延滯期縮短并很快到達對數生長期，營養物質在此階段被迅速消耗掉，不利于后期發酵的持續性進行，因此適宜的接種量有利于發酵過程的良好進行[14]。由圖5 可知，當接種量為1%～5%時，發酵液的DPPH 自由基清除率無顯著性差異，當接種量為0.5 %時，發酵液DPPH 自由基清除率則相對較低。考慮到經濟等因素，將發酵黃漿水的最適接種量定為1%。

2.2 響應面分析法優化黃漿水發酵液制備工藝

2.2.1 響應面優化試驗結果與分析

綜合單因素試驗結果，固定乳酸菌接種量1%，發酵溫度37 ℃，選擇發酵時間（A）、脫脂乳粉添加量（B）、葡萄糖添加量（C）3 個因素為自變量，以黃漿水發酵液提取物DPPH 自由基清除率為響應值，根據Box-Behnken 設計原理進行響應面試驗，試驗設計方案和結果如表2 所示，方差分析結果見表3。

回歸模型方程：DPPH 自由基清除率/%=77.63+2.06A+3.90B+3.11C+2.57AB-0.34AC-0.60BC-11.63A2-3.29B2-1.46C2。由表3 可知，模型 P 值小于 0.000 1，表示該回歸模型高度顯著；失擬項P 值為0.106 9，顯示該模型失擬不顯著；模型相關系數R2值為0.988 7，值為0.974 2，初步說明該模型具有較好的擬合度，試驗誤差較小。回歸方程各項的方差分析表明，A、C、AB、B2、C2均達到顯著水平，B、A2為極顯著水平。根據各因素F 值的大小可知，各因素主效應關系為：B（脫脂乳粉添加量）＞C（葡萄糖添加量）＞A（發酵時間）。

表2 Box-Behnken 響應面分析試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of response surface

表3 方差分析結果Table 3 ANOVA for response surface

圖6 是發酵時間（A）、脫脂乳粉添加量（B）和葡萄糖添加量（C）兩兩交互作用對黃漿水發酵液DPPH自由基清除率的三維響應面圖，直觀反映了各因素間的相互影響[15]。

圖6 三因素交互作用對DPPH 自由基清除率的影響Fig.6 Surface response plots showing the effect of three factors on the DPPH radical scavenging rate

圖6（a）顯示發酵時間和脫脂乳粉添加量有顯著交互作用，黃漿水發酵液DPPH 自由基清除率隨著兩者的升高均呈現先增加后減少趨勢。發酵時間與葡萄糖添加量的交互作用如圖6（b）所示，在一定發酵時間內，黃漿水發酵液的DPPH 自由基清除能力隨葡萄糖添加量的升高而升高，碳源的及時補充有利于發酵的正向進行，提高黃漿水發酵液的抗氧化活性。圖6（c）為發酵36 h 時的脫脂乳粉與葡萄糖添加量的交互作用響應面圖，葡萄糖可作為乳酸菌生長的碳源，其含量較低時，乳酸菌生長受限，而脫脂乳粉中含有蛋白質、小分子肽等乳酸菌生長所需的營養物質，能夠促進乳酸菌生長，進而對黃漿水中的活性物質進行生物轉化，提高發酵液的抗氧化活性。當葡萄糖添加量較高時，乳酸菌生長所需的碳源較為充足，能夠較好地完成發酵，從而削弱了脫脂乳粉對黃漿水發酵液抗氧化活性的影響。

經統計分析優化得到最佳發酵條件為：發酵時間37.65 h，脫脂乳粉添加量8.12 %，葡萄糖添加量4.93 %，此時發酵液DPPH 自由基清除率的理論值達到80.31 %。

2.2.2 最佳發酵條件驗證

結合實際可操作性，調整發酵條件為：發酵時間37.5 h，脫脂乳粉添加量8%，葡萄糖添加量5%，得到實際的發酵液DPPH 自由基清除率為（82.36±1.57）%，與預測值接近。由此可見該模型對黃漿水發酵工藝條件參數優化較為可靠，具有一定的實用價值。

2.3 黃漿水發酵液的體外抗氧化活性研究

優化發酵前后黃漿水提取物抗氧化活性見表4。

表4 優化發酵前后黃漿水提取物抗氧化活性的測定Table 4 Antioxidant activity of extracts from optimized fermented and unfermented tofu whey

如表4 所示，通過4 種不同的抗氧化體系來檢測優化發酵前后黃漿水抗氧化能力的變化。在最優發酵條件下所制備的黃漿水發酵液清除DPPH 自由基、ABTS 自由基和羥自由基能力均得到顯著提升。其中，發酵后黃漿水清除羥自由基的IC50值顯著低于陽性對照抗壞血酸（P＜0.05）。

研究表明，黃漿水發酵液的抗氧化效應是多種具有抗氧化活性的物質通過不同機制協同作用的結果。乳酸菌發酵提高黃漿水抗氧化活性可能與發酵過程中的蛋白水解、大分子酚類物質降解以及大豆異黃酮的生物轉化有關[16-17]。一方面，乳酸菌胞外酶能夠將外源大分子蛋白質逐步水解為具有抗氧化活性的多肽[18]。另一方面，發酵過程中復雜的大分子酚類物質被逐漸降解為小分子游離酚類物質，能夠與自由基反應形成較為穩定的酚氧自由基，從而降低自由基的氧化損傷[19-20]。此外，研究表明乳酸菌發酵有利于大豆異黃酮抗氧化活性和生物利用度的提高，這是由于乳酸菌產生的β-葡萄糖苷酶將糖苷型異黃酮轉化為游離苷元型異黃酮，苷元型異黃酮具有更強的抗氧化活性，且更易被腸道吸收[21-22]。

3 結論

在單因素試驗基礎上，以DPPH 自由基清除率為響應值，采用響應面法優化黃漿水發酵液制備條件。結果表明最佳發酵參數為：接種量1%、發酵溫度37 ℃、發酵時間37.50 h、脫脂乳粉添加量8%、葡萄糖添加量5%。在此條件下制備的黃漿水發酵液DPPH 自由基清除率為82.36%，與預測值接近，說明通過響應面法建立的回歸模型方程較為可靠。在最佳發酵條件下制備的黃漿水發酵液清除DPPH 自由基、ABTS 自由基以及羥自由基能力均得到顯著提升，為進一步開發黃漿水發酵飲料提供理論基礎。