地皮菜提取液的抗氧化性及抑菌作用研究

王迎進(jìn)，解晶晶，孫幸，姚聰，連舒婷，李海平

（忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西忻州034000）

地皮菜（Nostoc commune Vauch）又稱(chēng)地木耳、地軟、地耳、地衣等，為念珠藻屬植物，主要分布在石灰石區(qū)和碦斯特巖溶地帶[1]。地皮菜中含有豐富的蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗纖維、總糖、礦物質(zhì)、維生素、氨基酸、藍(lán)藻素、多糖、鈣、磷、鐵等各種元素、營(yíng)養(yǎng)和藥用成分，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和開(kāi)發(fā)利用前景[2]。據(jù)中國(guó)藥典記載，地皮菜對(duì)補(bǔ)充維生素、蛋白質(zhì)、清熱解毒、滋陰潤(rùn)肺、益氣明目、皮疹赤熱等具有明顯滋補(bǔ)食療效果[3]。目前有關(guān)地皮菜的提取工藝的報(bào)道較多，而有關(guān)地皮菜功能成分的研究報(bào)道較少[4]。本試驗(yàn)對(duì)地皮菜提取液的抗氧化能力、還原能力以及抑菌作用做了一個(gè)較為系統(tǒng)的研究，旨在為地皮菜的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地皮菜：山西忻州農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；氯化硝基四氮唑藍(lán)（nitroblue tetrazolium chloride，NBT）、吩嗪硫酸甲酯（phenazine methosulfate，PMS）、還原型輔酶 1（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、二苯基苦基苯肼（DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）：Sigma 公司；試劑均為分析純。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、LB 培養(yǎng)基：忻州師范學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-1800）：上海美譜達(dá)儀器有限公司；超聲波清洗器（KQ-400KDE）：昆山市超聲儀器有限公司；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2F）：蘇州凈化設(shè)備有限公司；全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋（D-1）：上海喬躍電子有限公司；恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱（HWS-150）：北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 地皮菜活性成分的提取

地皮菜水洗，烘干、粉碎、過(guò)篩60 目篩。稱(chēng)取5.000 g 地皮菜粉末4 份分別置于300 mL 錐形瓶中，分別加入100 mL 的蒸餾水、40 %乙醇、70 %乙醇和無(wú)水乙醇，在65 ℃下超聲輔助提取30 min，超聲功率為320 W。冷卻離心，導(dǎo)出上清液，將濾渣重復(fù)提取2 次。合并濾液，抽濾，濃縮至200 mL，用提取劑定容至250 mL。

1.3.2 抗氧化能力測(cè)定

1.3.2.1 羥基自由基清除能力測(cè)定

向比色管中加入0.30、0.60、0.90、1.20、1.50、1.80、2.10、2.40、2.70、3.00mL 的地皮菜提取液，加蒸餾水至 3.00 mL，依次加 6 mmol/L FeSO4溶液 2.00 mL，2.4 mmol/L 的H2O2溶液 2.00 mL，搖勻，靜置 10 min，加入 6 mmol/L水楊酸溶液 2.00 mL，搖勻，37 ℃水浴30 min，離心（3 000 r/min）10 min。取上清液于520 nm 測(cè)吸光度（Ai），以蒸餾水代替水楊酸做參比調(diào)零（Aj）。以蒸餾水代替樣品液做空白對(duì)照（A0），平行測(cè)定3 次[5]。

羥基自由基清除率S/%=[1-（Ai-Aj）/A0）]×100

1.3.2.2 超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

吸取 1.00 mL 150 μmol/LNBT，1.00 mL 60 μmol/L PMS 于比色管中，分別加入 0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00 mL 樣品液，補(bǔ)加蒸餾水至 4.00 mL，混勻，加入 1.00 mL 468 μmol/L NADH（由16 mmol/L Tris-HCl 在pH 8 時(shí)配制而成）。于 560 nm處測(cè)定樣品吸光度（Ai），以蒸餾水代替PMS 溶液做參比參比調(diào)零（Aj）。以蒸餾水代替樣品液做樣品空白對(duì)照（A0），平行測(cè)定 3 次[6]。

超氧陰離子自由基清除率S/%=[1-（Ai-Aj）/A0）]×100

1.3.2.3 DPPH·清除能力測(cè)定

向比色管中分別加入 0.30、0.60、0.90、1.20、1.50、1.80、2.10、2.40、2.70、3.00 mL 提取液，用蒸餾水補(bǔ)至3.00 mL，混勻，加入 2.00 mL 濃度為 2×10-4mol/L DPPH·溶液，放置30 min，于517 nm 處測(cè)定其吸光度（Ai），以無(wú)水乙醇代替DPPH·溶液做參比調(diào)零（Aj）。以無(wú)水乙醇代替地皮菜提取液做樣品空白對(duì)照（A0），平行測(cè)定 3 次[7]。

DPPH·的清除率S/%=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

1.3.2.4 ABTS+·總抗氧化能力測(cè)定

將 5.00 mL 7 mmol/L 的 ABTS 和 88 μL 140 mmol/L的過(guò)硫酸鉀混合，在25 ℃、避光的條件下靜置過(guò)夜，形成ABTS+·儲(chǔ)備液，使用前用無(wú)水乙醇稀釋成工作液。在734 nm 波長(zhǎng)下的吸光度為0.7±0.02。吸取 0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、0.36、0.40 mL 地皮菜提取液于比色管中，加蒸餾水至0.40 mL。加入2.00 mL ABTS+·，振蕩30 s，25 ℃下靜置6 min。在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定地皮菜提取液樣品的吸光度值（Ai），以80%乙醇溶液代替ABTS+·溶液做參比調(diào)零（Aj）。以蒸餾水代替樣品液做樣品空白對(duì)照（A0），平行測(cè)定3 次[8]。

ABTS+·總抗氧化能力的清除率S/%=1-[（Ai-Aj）/A0]×100

1.3.2.5 還原性測(cè)定

分 別 吸 取 0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80、2.00 mL 的地皮菜提取液于比色管中，加蒸餾水至 2.00 mL。加入 2.50 mL 10 g/L K3Fe（CN）6，2.50 mL 0.2 mol/L（pH 6.6）的磷酸鹽緩沖溶液，混勻。50 ℃水浴反應(yīng)20 min。再加入2.50 mL 100 g/L 三氯乙酸。離心10 min，取5.00 mL 上層溶液，加5.00 mL 蒸餾水，1.00 mL 1 g/L FeCl3。在 700 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[9]。1.3.3 抑菌作用

1.3.3.1 菌懸液的及含菌平板制備

將供試菌種分別用無(wú)水乙醇制成均勻菌懸液（約1011cfu/L）。將融化后的滅菌培養(yǎng)基傾入培養(yǎng)皿中，凝固后加入0.2 mL 菌懸液，用無(wú)菌布環(huán)涂均勻。37 ℃培養(yǎng)24 h，備用。

1.3.3.2 抑菌效果的測(cè)定

用打孔器在培養(yǎng)基上打4 個(gè)孔（呈十字形），各孔中心距離相距25 mm 以上，無(wú)菌條件下用移液槍將不同提取液注射到孔中，將接種培養(yǎng)皿放入37 ℃恒溫箱中培養(yǎng) 24 h，測(cè)定菌圈直徑（mm）[10-13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 地皮菜提取液對(duì)羥基自由基清除作用

·OH 是目前所知活性氧中對(duì)生物體毒性最強(qiáng)，危害最大的一種自由基，可與生物體內(nèi)多種分子作用，造成糖類(lèi)、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)氧化損傷，使細(xì)胞壞死或突變[14-16]。因此·OH 清除率是反映藥物抗氧化作用的重要指標(biāo)。地皮菜提取液清除羥基自由基能力見(jiàn)圖1。

圖1 地皮菜提取液清除羥基自由基能力Fig.1 Scavening rates of the extracts from Nostoc commune Vauch on·OH

如圖1 所示，4 種提取液對(duì)·OH 均具有較好的清除作用，隨提取液用量的增加清除率逐漸增大。其中水提取液清除·OH 的能力明顯高于其它3 種提取液。當(dāng)提取液用量為3.00 mL 時(shí)，水提液、40%乙醇提取液、70%乙醇提取液、無(wú)水乙醇提取液的清除率分別為：62.63%、55.26%、53.55%、47.38%。

2.2 地皮菜提取液對(duì)超氧陰離子自由基清除作用

O2-·是人體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基，能引發(fā)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)堿化，加快機(jī)體衰老過(guò)程，嚴(yán)重危害人體健康。地皮菜提取液對(duì)O2-·的清除作用如圖2 所示。

圖2 地皮菜提取液清除超氧陰離子自由基能力Fig.2 Scavening rates of the extracts from Nostoc Commune Vauch on O2-·

水提液對(duì)O2-·的清除作用最好，無(wú)水乙醇提取液最差。O2-·的清除作用隨提取液用量的增加逐漸增大，隨著提取液乙醇濃度的增加逐漸減小。當(dāng)提取液用量為2.00 mL 時(shí)，水提液、40%乙醇提取液、70%乙醇提取液和無(wú)水乙醇提取液的清除率分別為：93.45 %、68.78%、50.95%和20.57%。

2.3 地皮菜提取液對(duì)DPPH·的清除作用

DPPH·是一種以氮為中心的穩(wěn)定自由基，在517 nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)吸收，當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，由于與其單電子數(shù)配對(duì)而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其所接受的電子成定量關(guān)系[17-18]。地皮菜提取液清除DPPH·能力見(jiàn)圖3。

圖3 地皮菜提取液清除DPPH·能力Fig.3 Scavening rates of the extracts from Nostoc commune Vauch on DPPH·

由圖3 可知，4 種地皮菜提取液都具有不同程度的清除DPPH·能力，且清除能力與提取液用量呈正相關(guān)。當(dāng)提取液用量較小時(shí)，4 種提取液清除能力接近。但隨著提取液用量的增加，水提取液和40%乙醇提取液清除DPPH·能力顯著增加，明顯優(yōu)于70%乙醇和無(wú)水乙醇提取液。當(dāng)提取液用量為3.00 mL 時(shí)，水提取液、40%乙醇提取液、70%乙醇提取液和無(wú)水乙醇提取液對(duì)DPPH·的清除率分別為：96.73 %、87.52 %、72.07%、52.23%。

2.4 地皮菜提取液對(duì)ABTS+·抗氧化能力

ABTS 在氧化劑作用下可以被氧化成綠色ABTS+·，抗氧化物存在時(shí)ABTS+·的產(chǎn)生會(huì)被抑制。可以通過(guò)測(cè)定734 nm 處吸光度來(lái)評(píng)價(jià)樣品的總抗氧化能力[19]。4 種地皮菜提取液對(duì)ABTS+·抗氧化能力如圖4 所示。

圖4 地皮菜提取液總抗氧化能力的測(cè)定Fig.4 The scavening rates of extracts from Nostoc commune Vauch on ABTS+·

由圖4 可知，隨著提取液用量的增加，提取液的總抗氧化能力不斷增強(qiáng)。其中，水提液的清除能力最強(qiáng)，40%乙醇和70%乙醇提取液清除ABTS+·能力接近，均明顯高于無(wú)水乙醇提取液。當(dāng)提取液用量為0.40 mL時(shí)，水提液、40 %乙醇提取液、70 %乙醇提取液和無(wú)水乙醇提取液對(duì)ABTS+·的清除率分別為：92.09 %、80.84%、83.30%、24.87%。

2.5 地皮菜提取液還原能力的測(cè)定

地皮菜提取液還原能力如圖5 所示。

圖5 地皮菜提取液的還原能力Fig.5 The reducing capacity of extracts from Nostoc commune Vauch

地皮菜提取液均具有一定還原性。其中水提取液、40 %無(wú)水乙醇提取液和70 %無(wú)水乙醇提取液的還原能力比較接近，明顯高于無(wú)水乙醇提取液的還原能力較低。隨著提取液用量的增大，其還原性也隨之增強(qiáng)[20]。

2.6 抑菌作用

選擇大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌作為試驗(yàn)菌種，對(duì)地皮菜提取液的抑菌作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)抑菌圈直徑測(cè)量后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析如表1 所示。

表1 地皮菜提取液的抑菌作用Table 1 The bacteriostatic action of extracts from Nostoc commune Vauch

由表1 可知，4 種提取液對(duì)3 種菌種都有不同程度的抑制作用。其中，水提液對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑制作用最強(qiáng)，其抑菌圈直徑分別為（0.02±0.41）mm 和（2.51±0.32）mm。無(wú)水乙醇提取液對(duì)大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈的直徑為（17.53±0.33）mm。

3 結(jié)論

地皮菜不同提取液均具有明顯的清除羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH·和ABTS+·作用和還原能力。其清除作用和還原能力與提取液用量呈正相關(guān)。地皮菜水提取液清除4 種自由基作用和還原能力最強(qiáng)，無(wú)水乙醇提取液的清除作用和還原能力最弱。抑菌作用分析表明地皮菜水提液對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的具有良好的抑制作用，而無(wú)水乙醇提取液對(duì)大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)。