正交試驗優化鲬魚微凍復合保鮮劑配方研究

徐倩，劉曉攀，趙永慧，胡馨月，劉冰，趙行，王祥鵬，盤賽昆，3，4，*

（1.淮海工學院海洋生命與水產學院，江蘇連云港222005；2.江蘇天邊漁村食品有限公司，江蘇連云港222100；3.江蘇省海洋資源開發研究院，江蘇連云港222005；4.淮海工學院江蘇省海洋生物產業技術協同創新中心，江蘇連云港222005）

鲬魚（Platycephalus indicus）又名印度鲬、牛尾魚，廣泛分布于中國沿海各水域以及日本南部海域，為我國近海常見經濟魚類之一，也是我國重要的出口魚類[1]。因其味道鮮美，富含高蛋白、多種維生素和礦物質等，具有較高的營養價值和保健價值深受消費者歡迎。但是，由于鲬魚水分含量高，蛋白含量豐富，在儲運、加工及銷售過程中極易腐敗變質，從而導致資源浪費和經濟損失。因此，尋找一種適宜的保鮮技術來延長鲬魚的貨架期具有重要的現實意義和應用價值。國內外對水產品保鮮的研究更趨向于保鮮劑結合其他處理方式，以發揮其協同效應，達到抑菌保鮮的效果[2]。現有的保鮮方式主要有低溫保鮮、保鮮劑保鮮、氣調保鮮與輻照保鮮，其中保鮮劑結合低溫保鮮是水產品常用保鮮技術[3]。現有研究表明，復合保鮮劑的綜合保鮮效果優于單一保鮮劑。如張璟晶等[4]將0.4 g/L溶菌酶、0.4 g/L Nisin 與5 g/L 殼聚糖復配使用，在冷藏條件下可將銀鯧的一級鮮度延長2 d～3 d，二級鮮度延長6 d～7 d。國外研究者發現Nisin、茶多酚與殼聚糖復配協同效果良好，能明顯抑制微生物的生長[5]。

茶多酚（tea polyphenols，TP）是茶葉中多羥基酚類化合物的混合物。其易溶于水和有機溶劑，具有抗氧化和清除自由基、抑制微生物生長、抑制腫瘤細胞生長等多種生物活性，應用于食品貯藏與醫療衛生等領域，尤其在水產品保藏中得到較好應用[6]。殼聚糖（chitosan，CH）是甲殼素經化學處理脫乙酰基后的產物。殼聚糖含有游離氨基，能溶于低酸度水溶液中，是一種堿性多糖，其抑菌范圍廣、抗菌活性強、安全無毒，作為一種新型的動物源保鮮劑，在果蔬與水產品保鮮中得到普遍應用[7]。普魯蘭多糖（pullulan polysaccha ride，PP）是一種由出芽短梗霉發酵所產生的類似葡聚糖、黃原膠的胞外水溶性黏質多糖，其分子量在20 kDa～2 000 kDa，易溶于水，無毒無害，成膜性、阻氣性、可塑性和黏性均較強，己廣泛應用于果蔬、肉類等保鮮[8]。且GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[9]規定，以上3 種添加劑均允許在水產品及其制品中使用。成媛媛等[10]將0.5%普魯蘭多糖液用于草魚魚肉，在25 ℃條件下儲藏12 h 后其菌落總數和揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值均顯著低于空白對照組，保鮮效果最好。目前，國內外學者對鲬魚的研究甚少，主要集中在生物學方面，對研究鲬魚的貯藏保鮮缺乏相關報道。另外，水產領域常用的低溫保鮮技術有冷藏保鮮、冰溫保鮮、微凍保鮮以及凍結等保鮮技術[11]。其中，微凍保鮮技術是公認的低溫條件下可較好維持食物品質的方法[12]。微凍保鮮所需溫度區域介于冷藏和凍結之間。在這一溫度區域內微生物活性受到抑制，大多數細菌無法正常生長，同時內源酶的活力也受到抑制。鑒于此，本文選用微凍保藏觀察鲬魚貯運期間的品質變化，并配以茶多酚、殼聚糖和普魯蘭多糖這3 種天然食品保鮮劑來進行品質調控，旨在為鲬魚貯藏保鮮及延長貨架期提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鲬魚[體長約（380±10）mm，平均體重（100±10）g]：市購；茶多酚（多酚含量≥98%）、殼聚糖（脫乙酰度≥90%）、普魯蘭多糖（純度≥98%）（食品級）：河南巧手食品添加劑有限公司；硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid value，TBA）（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氯乙酸、丙二醛（分析純）：南京化學試劑有限公司；甘油、硼酸、鹽酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

722s 型可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；WSC-S 型測色色差計：上海儀電物理光學儀器有限公司；S20 型pH 計：梅特勒·托利多集團；BD-102型臥式冷凍柜：青島海爾股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理流程

將新鮮鲬魚經過去頭、去尾、去內臟的“三去”處理后，用流水洗凈后晾干，浸漬于不同配比的保鮮液中，鲬魚與保鮮液的質量體積比為2 ∶1，5 min 后撈出瀝干，用無菌保鮮袋分裝，放入冰箱于（-5±1）℃微凍，每隔 5 d 取樣測定 TVB-N 值、TBA 值、pH 值和色差值。未浸保鮮液的樣品設為空白對照。

用無菌蒸餾水分別將茶多酚、普魯蘭多糖和殼聚糖（殼聚糖配制時需另加1%的冰醋酸）配制成不同濃度的溶液備用。

1.3.3 單因素試驗設計

采用單因素試驗，考察茶多酚、殼聚糖和普魯蘭多糖對鲬魚微凍貯藏條件下的品質影響。茶多酚溶液質量分數設定為0.2%、0.4%、0.6%、殼聚糖溶液質量分數設定為1.0%、1.5%、2.0%、普魯蘭多糖溶液質量分數設定為0.25 %、0.5 %、0.75 %，每個水平設3 個重復。

1.3.4 復合保鮮劑配比優選

根據單因素試驗結果，以茶多酚、殼聚糖和普魯蘭多糖溶液質量分數為因素，每個因素設3 個水平，以儲存16 d 后鲬魚的TVB-N 值為參考指標，采用L9（34）正交試驗優選復合保鮮劑配比。因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.5 TVB-N 值

隨著供暖季臨近，中國石化天然氣保供工作全面提速。據統計，1至9月，中國石化累計供應天然氣290.1億立方米，同比增長18.1%。其中，LNG累計進口88.6億立方米，同比增加59.7%。中國石化正在加快鄂爾多斯-安平-滄州管道一期工程建設，預計11月中旬投產并實現向河北供氣。

參照GB 5009.228-2016《食品安全國家標準食品中揮發性鹽基氮的測定》[13]，采用第二法進行測定，平行測定3 次。

1.3.6 TBA 值

參考Sui 等[14]并做修改，稱取5 g 攪碎魚肉于錐形瓶內，加入25 mL7.5%的三氯乙酸混合液，振搖30 min，過濾2 次，取5 mL 濾液至25 mL 比色管中，再加入5 mL TBA 水溶液（0.02 mol/L），混勻后加塞，在（90±1）℃水浴 40 min，取出，冷卻至 25℃，1 600 r/min 離心 5 min，取上清液加5 mL 氯仿，搖勻并靜置，吸取上清液在532 nm 波長下測定吸光度。TBA 值用丙二醛的質量分數表示。

式中：C 為從標準曲線查得丙二醛的微克數，μg；m 為樣品質量，g。

1.3.7 pH 值

參照謝晶等[15]建立的方法進行pH 值測定，稱取10.0 g 魚肉，絞碎后加90 mL 煮沸冷卻過的蒸餾水，振蕩30 min 后過濾，用精密pH 計來測定其pH 值。

1.3.8 色差值

采用WSC-S 色差分析儀來測定魚肉的顏色變化。L*（lightness）為明度指數、a*（redness/greenness）表示紅綠偏差、b*（yellowness/blueness）表示黃藍偏差值，3 個指標值先用白板校準。L*=0 表示黑色，L*=100 表示白色；a*和b*為彩度指數，+a*表示紅色，-a*表示綠色，+b*表示黃色，-b*表示藍色。總顏色差異E*，用[（L*）2+（a*）2+（b*）2]1/2表示，E*越大，說明色差越大。

1.4 數據處理

試驗數據均為3 次以上重復試驗，用正交設計助手Ⅱ和Excel 軟件進行數據分析，并以±SD 表示。

2 結果與分析

2.1 茶多酚對鲬魚冷凍保藏效果的影響

茶多酚對鲬魚冷凍保藏效果的影響見圖1。圖1（a）表示不同濃度的TP 對鲬魚貯藏過程中TVB-N 值的影響。TVB-N 值是水產品在細菌和酶的作用下分解產生氨及低級胺類化合物，常測其總氮量作為魚類的鮮度指標。GB 2733-2015《食品安全國家標準鮮、凍動物性水產品》[16]規定海水魚 TVB-N 值（mg/100 g）≤30在可接受范圍內。圖1（b）表示不同濃度的TP 對鲬魚貯藏過程中TBA 值的影響。TBA 值是指肉類、魚類等動物性油脂中不飽和脂肪酸氧化分解后所產生的衍生物如丙二醛（malondialdehyde，MDA）等與 TBA 試劑反應的結果[17]。TBA 值越大，脂肪的氧化程度越高，因此TBA 值是測定水產品脂肪氧化酸敗程度的良好判斷指標。圖1（c）表示不同濃度的TP 對鲬魚貯藏過程中pH 值的影響。圖1（d）表示不同濃度的TP 對鲬魚貯藏過程中色差的影響。顏色的變化主要源于魚肉蛋白質氧化后血紅蛋白的減少導致的整體色差的下降。

圖1 不同濃度的茶多酚對鲬魚冷藏效果的影響Fig.1 Effect of different concentrations of tea polyphenols on the effect of Platycephalus induicus

如圖1（a）所示，隨著貯藏時間的延長，TVB-N 值不斷上升。其中，采用0.2%的TP 處理的鲬魚TVB-N值最低，第 16 天時其 TVB-N 值為（21.55±0.27）mg/100 g，而空白對照組的 TVB-N 值為（30.98±0.82）mg/100 g，與空白對照組相比具有顯著性差異（P<0.05）。如圖1（b）所示，鲬魚在整個冷藏過程中的TBA 值呈不斷上升趨勢，這表明魚肉氧化酸敗程度越來越嚴重。添加TP 的試驗組均能延緩鲬魚的TBA 值，說明TP 能有效抑制鲬魚脂肪氧化酸敗。其中，0.2%的TP 處理的鲬魚TVB 值最低，第 16 天時其 TBA 值為 0.275 mg/kg 顯著低于空白對照組的TBA 值為0.434 mg/kg（P<0.05）。如圖1（c）所示，鲬魚在整個貯藏過程中呈現先降低后升高的V 型趨勢，這與蘇輝等[18]的研究結果類似。鲬魚樣品的pH 值在最初6 d 內呈現出下降趨勢，第6 天時，空白對照組pH 值明顯增加。隨著鲬魚貯藏時間的延長，蛋白質被分解成堿性的胺及氨類物質，pH 值逐漸升高。pH 值越大，表明樣品的腐敗程度越高。采用TP 處理后的樣品，其pH 值均較空白對照組低，其中0.2%處理的pH 值最低。如圖1（d）所示，空白對照組的色差在小范圍內呈現下降趨勢，0.2%的TP 對于降低色差變化的效果最佳。

2.2 殼聚糖對鲬魚冷凍保藏效果的影響

殼聚糖對鲬魚冷凍保藏效果的影響見圖2。

圖2 不同濃度的CH 對鲬魚冷藏效果的影響Fig.2 Effects of different concentrations of chitosan on the effect of Platycephalus induicus

圖2（a）表示不同濃度的CH 對鲬魚貯藏過程中TVB-N 值的影響。隨著貯藏時間的延長，用CH 處理鲬魚的TVB-N 值低于對照組。其中采用1.0%的CH處理鲬魚的TVB-N 值最低，到貯藏末期（16 d）其TVB-N 值為（18.80±1.14）mg/100 g 顯著低于對照組的TVB-N 值（30.25±0.82）mg/100 g（P<0.05）。李婷婷等[19]的研究表明，殼聚糖用于處理大黃魚能夠明顯降低TVB-N 值，從而降低腐敗的速率，CH 處理鲬魚具有相似的現象。圖2（b）表示不同濃度的CH 對鲬魚貯藏過程中TBA 值的影響。隨著時間的延長，所有組的TBA值總體呈上升趨勢，其中，1.0%CH 試驗組的TBA 值均低于其它3 組。在第16 天時，1.0%CH 試驗組TBA值為0.24 mg/kg 顯著低于空白對照組的0.434 mg/kg。因為殼聚糖具有良好的成膜性，能夠有效阻隔氧氣，從而抑制脂質氧化。圖2（c）表示不同濃度的CH 對鲬魚貯藏過程中pH 值的影響。如圖2（c）所示，隨著時間的延長，pH 值呈先下降后上升的趨勢。其中，1.0%的試驗組和空白對照組相比具有顯著性差異。這說明一定濃度的CH 能夠有效抑制魚體腐敗微生物的繁殖，保持魚肉品質。圖2（d）表示，不同濃度的CH 對鲬魚貯藏過程中色差的影響。如圖（d）所示，隨著時間的延長，各試驗組的色差值總體呈下降趨勢。其中，1.0%CH 對鲬魚貯藏過程中影響效果最好，且與空白對照組有顯著差異。

2.3 普魯蘭多糖對鲬魚冷凍保藏效果的影響

普魯蘭多糖對鲬魚冷凍保藏效果的影響見圖3。

圖3 不同濃度的普魯蘭多糖對鲬魚冷藏效果的影響Fig.3 Effects of different concentrations of pullulan polysaccharides on the effect of Platycephalus induicus

圖3（a）表示不同濃度的PP 對鲬魚貯藏過程中T VB-N 值的影響。如圖（a）所示，空白試驗組的TVB-N值增加非常迅速，在第16 天時其TVB-N 值達（31.79±0.82）mg/100 g；而經 PP 處理的鲬魚其 TVB-N 值增加較緩，尤其是經0.25%PP 處理的鲬魚在貯藏16 d 后其 TVB-N 值僅為（20.19±1.91）mg/100 g，由此可見 PP能有效抑制鲬魚體內TVB-N 的產生，其主要緣于PP良好的阻氧性抑制了鲬魚體內酶和細菌的生物活性[20]。圖3（b）表示不同濃度的PP 對鲬魚貯藏過程中TBA值的影響。如圖3（b）所示，經過PP 處理后的鲬魚TBA值高于空白對照組，但在試驗第16 天時，PP 處理過的樣品則表現出TBA 值明顯低于空白對照組的TBA值，說明達到PP 對于水產品的貯藏效果需要一定時間。其中，0.25%PP 處理的效果最佳，說明濃度過高的PP 形成的膜可能對于O2的選擇通過性不如低濃度的PP 效果好。圖3（c）表示不同濃度的PP 對鲬魚貯藏過程中pH 值的影響。如圖3（c）所示，鲬魚的pH 值隨著貯藏時間的延長呈先下降后上升趨勢，經PP 處理后，鲬魚的pH 值變化較緩慢，其中0.25%PP 試驗組較明顯。圖3（d）表示不同濃度的PP 對鲬魚貯藏過程中色差值的影響。如圖3（d）所示，隨著貯藏時間的延長，鲬魚的色差值呈緩慢下降趨勢。其中，0.25%和0.75%的PP 處理過的鲬魚色差值變化范圍較小，綜合以上3 個測定指標選擇0.25%PP 試驗組為最佳。

2.4 復配結果

根據單因素試驗結果，以鲬魚儲藏16 d 后的TVB-N 值為指標進行復合保鮮劑最佳配比優化。試驗方案設計與結果見表2。

表2 鲬魚復合保鮮劑最佳比例正交試驗結果Table 2 Results of Platycephalus indicus fresh-keeping orthogonal experiment

表3 正交試驗方差分析結果Table 3 Analysis of variance for the analysis orthogonal array design

由表2、表3 分析可知，殼聚糖和茶多酚對微凍鲬魚TVB-N 值的影響效果顯著，普魯蘭多糖的影響不顯著。各因素對微凍鲬魚TVB-N 值的影響主次順序為A＞B＞C，即殼聚糖用量＞茶多酚用量＞普魯蘭多糖用量。復配組合A1B2C1為減緩TVB-N 值增加的最優配比。即復合保鮮劑的最佳配比為0.8%CH、0.2%TP 和0.15%PP。

2.5 驗證試驗

采用正交后的最佳復配進行驗證試驗，即采用0.8%CH、0.2%TP 和 0.15%PP 進行復配在第 16 天測定 TVB-N 值、TBA 值、pH 值和總色差，其結果分別為10.526 mg/100 g、0.162 mg/kg、7.01、40.25，符合國家標準GB 2733-2015《食品安全國家標準鮮、凍動物性水產品》的衛生指標。

3 結論

采用正交試驗組合復配3 種保鮮劑，對3 種保鮮劑復合使用的濃度進行了優化，最終確定了鲬魚貯藏保鮮劑的工藝參數為CH 添加量為0.8%、TP 添加量為0.2%、PP 添加量為0.15%，在此配方條件下對鲬魚微凍保藏16 d，產品各項指標均明顯優于空白對照組，說明這3 種保鮮劑處理鲬魚后再進行微凍保鮮能抑制細菌繁殖，延緩腐敗變質，改善鲬魚保藏品質。