藜麥芽多肽制備及其應用研究

李可心，潘其迪，衣艷嬌，楊倩，賈麗娜，徐慧

（河北農業大學理工學院，河北滄州061000）

藜麥是一種營養豐富的糧食作物，其種子含有豐富的必需氨基酸、礦物質和不飽和脂肪酸[1-4]。1989 年美國國家科學院將藜麥作為植物王國中最好的蛋白質來源[5]。藜麥中蛋白質含量高達12%～23%[6-7]，超過了小麥、大麥等主流谷物中的蛋白質含量[8]。基于其豐富的蛋白質含量，對于多肽的制備具有開發的潛力。多肽具有良好的營養特性，易消化吸收[9]，對降低膽固醇、降血壓、促進脂肪代謝、抗疲勞、增強人體免疫力、調節人體生理機能具有輔助治療作用[10-13]。

現有研究結果表明，藜麥中含有具有抗氧化肽功能的活性肽[14]。田旭靜[15]研究發現藜麥多肽含有18 種氨基酸，其還原能力為0.644，對超氧陰離子和羥基自由基具有較好的清除能力。胡潔[16]、黃金[17]等研究結果表明，藜麥在萌芽過程中生物活性成分會顯著增加。目前對于藜麥多肽相關功能性食品、功能性添加劑開發較少[18]，藜麥多肽相關產品在市場上仍是一個空缺[4]。因此，本試驗通過優化藜麥芽培養工藝條件，培養出富含多肽、營養價值較高的多肽藜麥芽，制備多肽藜麥芽粉，并在此基礎上研究多肽藜麥芽粉在飲料中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藜麥：山東老鄉生態農業有限公司；氯化鈉、硫酸錳、氯化鈣、氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、三氯乙酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；牛血清白蛋白（分析純，純度：98%）：賽國生物試劑公司。

UV-1200 紫外分光光度計：上海美普達儀器有限公司；JRJ300-SH 均質機：上海標本模廠；SC-04 離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；HH-8 電子恒溫水浴鍋：沃信科技有限公司；HSP-80B 恒溫恒濕培養箱：上海秉越電子儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 藜麥芽的培養

樣品預處理：取3 g 藜麥，經超純水清洗后于1%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，達到殺菌目的，然后用超純水清洗至pH 值為中性。

藜麥芽培養：課題組前期工作已確定藜麥芽培養液各組分濃度為硫酸錳1.32 mmol/L，氯化鈉3.26 mmol/L，氯化鈣1.09 mmol/L。取浸泡好的藜麥置于放有上述培養液的燒杯中，于一定溫度下水浴一段時間。將藜麥取出平鋪入放有雙層濕潤濾紙的培養皿中，于恒溫恒濕培養箱中（相對濕度為80%～90%）25 ℃避光培養一段時間，每12 h 噴灑一次超純水（達到濾紙飽和為宜），以保持藜麥濕潤。

儲存：將藜麥芽取出用超純水清洗，置于-80 ℃冰箱，并在試驗期間取出。

1.2.2 多肽含量的測定

1.2.2.1 標準曲線的繪制

以牛血清白蛋白為標準品配置不同濃度標準蛋白溶液，取1 mL 標準蛋白溶液加4 mL 雙縮脲試劑，充分搖勻后37 ℃水浴20 min 后于540 nm 波長下比色測定。

1.2.2.2 樣品多肽含量的測定

參考溫煥斌[19]檢測方法進行。取1 g 藜麥芽于研缽中，加入5 mL 超純水研磨，4 000 r/min 下離心15 min，棄去沉淀得上清液①。取上清液①2 mL 加入2 mL 三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）12 000 r/min 離心 15 min，棄去沉淀得上清液②，取1 mL 上清液②加入4 mL 雙縮脲試劑，充分搖勻后37 ℃水浴20 min 后于540 nm波長下比色測定。

1.2.2.3 計算公式

樣品中多肽含量/（mg/g）=2 CV/m

式中：C 為標準品質量濃度，mg/mL；V 為加入超純水體積，mL；m 為樣品質量，g；2 為稀釋倍數。

1.2.3 單因素試驗

在預試驗的基礎上，通過單因素試驗探討浸泡溫度、浸泡時間、培養時間3 個因素對藜麥芽中多肽含量的影響。

固定浸泡時間為4 h，培養時間為48 h，浸泡溫度分別為 20、25、30、35、40 ℃，培養藜麥芽。

固定培養時間為48 h，浸泡溫度為25 ℃，浸泡時間分別為 2、4、6、8、10 h，培養藜麥芽。

固定浸泡溫度為25 ℃，浸泡時間為4 h，培養時間分別為 24、48、72、96、120 h，培養藜麥芽。

1.2.4 正交試驗優化

在單因素的基礎上，以培養時間、浸泡時間、浸泡溫度為影響因素，進行三因素三水平正交優化試驗設計。

1.2.5 多肽藜麥芽粉的制備

取多肽藜麥芽按料水比1 ∶12（g/mL）進行低溫打漿（水溫4 ℃），然后進行冷凍干燥，收集冷凍干燥產物并進行粉碎得到多肽藜麥芽粉。

1.2.6 多肽藜麥芽粉在飲料中的應用

將1.2.5 中制備得到的多肽藜麥芽粉按一定質量體積比與純凈水調配得到多肽藜麥芽飲料，對多肽藜麥芽粉不同添加量的多肽藜麥芽飲料進行初步感官評價。

1.2.7 質量指標檢測

參考GB/T15672-2009《食用菌中總糖含量的測定》[20]測定總糖含量；參考雙縮脲比色法測定多肽含量；參考GB4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》[21]檢測菌落總數；參考GB 4789.3-2016 《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》[22]檢測大腸菌群；參考GB 29921-2013《食品安全國家標準食品中致病菌限量》[23]檢測致病菌。

1.2.8 統計分析

每個樣品進行重復3 次平行試驗，匯總數據并計算平均值及其標準偏差，單因素試驗內計算組內差異顯著性。運用Excel 2010 進行數據分析，運用IBM SPSS Statistics 25 進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

牛血清蛋白標準曲線見圖1。

圖1 牛血清蛋白標準曲線Fig.1 Bovine serum albumin standard curve

分別配制 20、30、40、50、60、70 mg/mL 牛血清蛋白標準溶液，按1.2.2.1 的方法測定吸光度。牛血清蛋白標準溶液濃度為橫坐標x，吸光度為縱坐標y，制作標準曲線見圖1，所得回歸方程y=0.009 5x+0.250 5，R2=0.987 4。

2.2 單因素試驗結果

浸泡溫度對多肽含量的影響見表1。

表1 浸泡溫度對多肽含量的影響Table 1 Effect of soaking temperature on peptide content

由表1 可知，浸泡溫度對多肽含量的影響顯著（p＜0.05）。隨浸泡溫度的升高，多肽含量先升高后降低。多肽富集最佳浸泡溫度范圍為20 ℃～30 ℃。這可能是由于溫度過高抑制種子呼吸，氧氣進入種子緩慢使許多耗氧反應受抑制，新陳代謝緩慢，生命活動所需的中間物質的形成受抑制，表現為多肽含量下降。溫煥斌[19]研究發現，合適的浸泡溫度有利于提高藜麥芽生命活力從而提高蛋白酶活力。當溫度在25 ℃前后時，對于藜麥芽萌發較適宜，此時可能蛋白酶活力較高，有利于蛋白質向多肽的轉變，利于多肽的富集。浸泡時間對多肽含量的影響見表2。

表2 浸泡時間對多肽含量的影響Table 2 Effect of soaking time on peptide content

從表2 可以看出，隨浸泡時間的延長，多肽含量先增加后降低。當浸泡時間在2 h～4 h 范圍內時，隨浸泡時間的延長，多肽含量顯著增加，浸泡時間對多肽含量影響在4 h～6 h 范圍內不顯著，隨浸泡時間的進一步延長，多肽含量呈下降趨勢。浸泡時間過短會導致種子吸水不充分，發芽過程中容易失水，而長時間的浸泡易造成種子腐爛，經試驗中觀察發現，浸泡時間超過6 h～8 h，種子表面開始有滑膩感，藜麥種子較小，吸水較快，不適合長時間浸泡。

培養時間對多肽含量的影響見表3。

表3 培養時間對多肽含量的影響Table 3 Effect of culture time on peptide content

由表3 可知，隨培養時間的延長，多肽含量先增加后降低，培養時間對多肽含量的變化影響顯著（p＜0.05）。藜麥芽萌發初期種子活化，耗能較少，開始進入萌發階段胚芽長出，形成新的芽體組織，芽體急速生長，細胞大量形成，伴隨著蛋白質的參與，為了維持這些新形成的細胞內的生命活動，儲能大分子物質大量轉化為中間產物，所以檢測到的多肽含量升高，隨培養時間的延長開始進行物質的合成消耗已形成的中間產物導致多肽含量降低，在培養時間為48 h 時，多肽含量達到最大值。

2.3 正交優化試驗結果

正交試驗方案及試驗結果見表4。

表4 正交試驗方案及試驗結果Table 4 Orthogonal test plan and test results

由表4 可知，以多肽含量為指標，各因素的影響依次為C＞B＞A，即培養時間對多肽含量的影響最大，其次是浸泡時間，浸泡溫度對藜麥芽多肽含量的影響最小。由正交試驗結果分析確定最佳培養條件：A2B2C2，即培養時間為48 h，浸泡時間為4 h，浸泡溫度為25 ℃。

2.4 驗證試驗

為驗證正交試驗所得結果的可靠性，在上述最佳培養條件下進行3 次平行試驗并測定藜麥芽中多肽含量。經測定，所得藜麥芽中多肽含量為（12.4±1.13）mg/g，大于（11.45±0.88）mg/g，所以最佳培養條件為培養時間為48 h，浸泡時間為4 h，浸泡溫度為25 ℃。

2.5 多肽藜麥芽粉質量指標檢測結果

微生物檢驗結果如表5 所示。

表5 微生物檢驗結果Table 5 Microbiological test results

多肽藜麥芽粉中菌落總數、大腸菌群數、霉菌數均為0 CFU/mL，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均未檢出，說明本產品符合國家衛生標準。營養指標檢測結果見表6。

表6 營養指標檢測結果Table 6 Test results of nutritional indicators

2.6 多肽藜麥芽粉在飲料中的應用

料水比對感官評定的影響見表7。

表7 料水比對感官評定的影響Table 7 Effect of water-to-water ratio on sensory evaluation

由2.5 檢測結果得出多肽藜麥芽粉末可以添加到飲料中作為營養型添加劑，從表7 中可以看出，料水比為10 g/100 mL 時達到較好的溶解度，口感順滑，添加量過少或者過多都會影響飲料的狀態和口感。

3 結論

多肽的營養功能性受到消費者的日益矚目，相關產品的研發具有良好的應用前景。本研究以白藜麥為原料，藜麥萌發過程中蛋白質向多肽的轉變，制備多肽藜麥芽，優化得到最佳多肽藜麥芽制備工藝為浸泡溫度25 ℃，浸泡時間4 h，培養時間48 h。在此工藝條件下，得到藜麥芽中多肽含量為（12.4±1.13）mg/g。將多肽藜麥芽制成多肽藜麥芽粉，作為營養型添加劑添加到食品中，可以提高食品中多肽含量，提高食品的營養功能性。