減施化肥對(duì)水稻土壤nirK型反硝化菌豐度的影響

方宇 王飛 賈憲波 林陳強(qiáng) 張慧 陳龍軍 陳濟(jì)琛

摘 要：設(shè)置不施肥（CK）、單施化肥（NPK），紫云英配施80%化肥（MF80）、紫云英配施60%化肥（MF60）和紫云英配施40%化肥（MF40）5個(gè)施肥處理，采用熒光定量PCR技術(shù)，研究了紫云英配施減量化肥對(duì)水稻土壤nirK型反硝化菌豐度的影響。結(jié)果表明，MF60處理是一種既節(jié)能又高效的施肥制度;種植綠肥的，土壤有機(jī)質(zhì)含量明顯增加，在化肥減施的情況下，土壤全氮和有效氮的含量并不降低;與單施化肥相比，綠肥配施減量化肥降低了土壤反硝化潛勢;種植綠肥的土壤nirK基因豐度顯著低于單施化肥處理;土壤nirK基因豐度與土壤反硝化潛勢呈極顯著正相關(guān)。

關(guān)鍵詞：綠肥;減施化肥;反硝化菌;nirK基因;熒光定量PCR

中圖分類號(hào) S154文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2020）01-0092-03

Abstract： The objective of this study was to explore the effect of long-term application of green manure and reduced chemical fertilizer on the abundance of nirK-type denitrifiers in a paddy soil. This study includes 5 treatments （i.e. no fertilizer treatment，CK; chemical fertilizer alone（NPK）;green manure plus 80% of the chemical fertilizer （MF80）; green manure plus 60% of the chemical fertilizer（MF60）; green manure plus 40% of the chemical fertilizer（MF40））. Results showed that MF60 treatment is the most appropriate fertilization regime. Application of green manure significantly increased the soil organic matter contents，and reduced chemical fertilizer did not decrease the contents of total nitrogen and available nitrogen. Green manure combined with reduced chemical fertilizer decreased the denitrification potential relative to that of the NPK treatment. NirK gene abundance in the green manure treatments was significantly lower than that of the NPK treatment. The abundance of nirK gene was positively correlated with the denitrification potential.

Key words： Green manure; Reduced chemical fertilizer; Denitrifiers; NirK gene; Real-time PCR

為了獲得作物高產(chǎn)，化肥使用量不斷增加，化肥的過量施用導(dǎo)致土壤質(zhì)量明顯下降[1]。綠肥是南方稻田重要的有機(jī)肥源，它是一種養(yǎng)分完全的優(yōu)質(zhì)生物能源，可提供作物所需養(yǎng)分、改善農(nóng)田生態(tài)環(huán)境，施用綠肥是保持土壤質(zhì)量和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的措施之一。因此，化肥和綠肥的合理配施是保障作物產(chǎn)量和改善土壤質(zhì)量的有效途徑。有機(jī)和無機(jī)肥的配合施用會(huì)改變土壤的性質(zhì)，從而可能影響土壤的養(yǎng)分循環(huán)。

反硝化過程是環(huán)境中氮循環(huán)的重要步驟之一[2]，不僅與農(nóng)田土壤氮素流失有關(guān)，同時(shí)也與溫室氣體N2O排放密切相關(guān)[3]。因此，研究反硝化過程對(duì)于保持土壤肥力、減少溫室氣體排放具有重要意義。反硝化過程包括NO3-→NO2-→NO→N2O→N24個(gè)步驟，每一步驟均是由不同種類的酶催化完成。由亞硝酸鹽還原為NO的過程是反硝化過程中最重要的限速步驟，而亞硝酸鹽還原酶（nir）是執(zhí)行該步驟的限速酶。催化該過程的亞硝酸鹽還原酶有2種，其中nirK型亞硝酸鹽還原酶含有銅離子，nirS型含有細(xì)胞色素cd1[4]。

施肥是土壤微生物演變的重要驅(qū)動(dòng)因子[5]。李靜[6]發(fā)現(xiàn)在化肥減量30%和50%基礎(chǔ)上，配施豬糞處理顯著提升了nirK的豐度。靳振江[7]報(bào)道化肥配施有機(jī)肥，土壤nirK基因豐度顯著高于單施化肥處理。然而，關(guān)于化肥配施綠肥對(duì)于土壤nirK型反硝化菌的影響研究甚少。因此，本研究依托長期定位試驗(yàn)站，采用熒光定量PCR技術(shù)，研究水稻土壤nirK型反硝化細(xì)菌豐度對(duì)綠肥配施減量化肥的響應(yīng)，以期為該地區(qū)的養(yǎng)分管理提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn) 紫云英定位試驗(yàn)站位于福州市白沙鎮(zhèn)，地理位置為北緯26°13′31″，東經(jīng)119°04′10″，海拔高度15.4m，年均降雨量1350.9mm，年日照時(shí)數(shù)1812.5h，年平均溫度19.5℃，無霜期311d;土壤類型為黃泥田。紫云英-水稻長期輪作定位試驗(yàn)始于2008年，試驗(yàn)開始時(shí)土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)：有機(jī)質(zhì)31.41g/kg、全氮1.23g/kg、有效氮132.31mg/kg、速效磷13.51mg/kg、速效鉀85.48mg/kg、pH5.26。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理：1）對(duì)照：不施紫云英和化肥，CK;2）單施化肥，NPK;3）紫云英（18000kg/hm2）+80%化肥：MF80;4）紫云英（18000kg/hm2）+60%化肥，MF60;5）紫云英（18000kg/hm2）+40%化肥，MF40。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)小區(qū)，完全隨機(jī)排列，每個(gè)小區(qū)面積為15m2，除第1年為異地方式翻壓外，其余每年水稻成熟前套播紫云英種子，于次年4月份翻壓。

1.3 樣品采集 土樣采集時(shí)間為2016年10月份（水稻收獲后）。各小區(qū)內(nèi)按“S”形取樣，隨機(jī)布點(diǎn)采集耕作層（0—20cm）土層樣品，混勻后置于無菌自封袋迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。部分土樣風(fēng)干后測定土壤養(yǎng)分;部分土樣于4°C保存用于測定土壤反硝化潛勢，部分土樣于-20°C保存用于提取土壤DNA。

1.4 測定方法 土壤pH值用蒸餾水浸提（水土比1∶2.5）pH計(jì)測定;有機(jī)質(zhì)測定采用K2Cr2O7-H2SO4外加熱法;全氮用半微量凱氏定氮法測定;有效氮采用堿解擴(kuò)散法測定;NH4+-N用2mol/L KCl溶液浸提-靛酚藍(lán)比色法測定;NO3--N用雙波長分光光度法測定[8]。反硝化潛勢的測定采用乙炔抑制法[9]，簡述如下：稱取10g鮮土，裝入100mL血清瓶中，加入10mL 1mmol/L的KNO3和葡萄糖混合液，采用丁基橡膠塞和鋁蓋密封，充氮?dú)?min，平衡至大氣壓后，充入10mL乙炔，樣品放置搖床，25°C培養(yǎng)6h，每2h采集氣體樣品，采用安捷倫7890A氣相色譜分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS19.0和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 減施化肥對(duì)水稻產(chǎn)量的影響 綠肥配施減量化肥對(duì)水稻產(chǎn)量（2009—2016年平均產(chǎn)量）的影響見圖1。由圖1可知，CK處理產(chǎn)量最低，為7002kg/hm2;MF80處理的產(chǎn)量最高，為8528kg/hm2。在翻壓紫云英的基礎(chǔ)上，減施化肥處理的水稻產(chǎn)量與單施化肥處理無顯著差異（p>0.05）。由此可見紫云英可以替代部分化肥。李雙來等[10]也認(rèn)為紫云英翻壓稻田能夠減少化肥用量，同時(shí)保持水稻產(chǎn)量和單施化肥無顯著差異。綜合化肥用量和水稻產(chǎn)量，MF60（產(chǎn)量為8194kg/hm2）是一種既節(jié)能又高產(chǎn)的施肥措施。

2.2 減施化肥對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響 土壤養(yǎng)分含量是實(shí)現(xiàn)作物高產(chǎn)的營養(yǎng)基礎(chǔ)。由表1可見，與單施化肥相比，配施綠肥處理明顯增加了土壤有機(jī)質(zhì)含量（p<0.05）。與對(duì)照相比，綠肥配施減量化肥增加了土壤全氮含量，而單施化肥處理與對(duì)照無顯著差異。施肥明顯增加了土壤有效氮含量，其中MF60處理的有效氮含量最高，可見化肥施用量的減少并未導(dǎo)致有效氮的減少。呂玉虎等[11]也指出減少化肥施用量時(shí)，翻壓紫云英也能為土壤提供較多的氮素營養(yǎng)。化肥處理降低了土壤銨態(tài)氮的含量，MF40處理土壤銨態(tài)氮含量最低。綠肥處理組中MF60和MF40處理的硝態(tài)氮含量低于單施化肥處理，而MF80處理與單施化肥處理無顯著差異。此外，施肥降低了土壤pH值，說明施肥可導(dǎo)致土壤酸化，但是各施肥處理間土壤pH值無顯著差異。

2.3 減施化肥對(duì)土壤反硝化潛勢的影響 由圖2可知，施肥處理土壤反硝化潛勢均明顯高于對(duì)照處理。與單施化肥相比，翻壓紫云英配施減量化肥降低了土壤反硝化潛勢。隨著化肥用量的減少，土壤的反硝化潛勢也隨之減少，而MF60和MF40處理之間土壤反硝化潛勢無顯著差異。由上可知，在化肥減量40%范圍內(nèi)，減少化肥的用量可以減少反硝化潛勢，從而減少氮素流失的風(fēng)險(xiǎn)。

2.4 減施化肥對(duì)土壤nirK型反硝化菌豐度的影響 綠肥配施減量化肥對(duì)水稻土壤nirK基因拷貝數(shù)的影響見圖3。比較不同施肥處理，對(duì)照組nirK豐度最低，僅為1.04×108/g;NPK處理nirK豐度最高，為4.89×108/g。與對(duì)照相比，單施化肥處理土壤nirK基因豐度明顯增加，而化肥配施綠肥處理與對(duì)照無顯著差異。與NPK處理相比，配施綠肥明顯降低了土壤nirK基因豐度，然而各綠肥處理之間無顯著差異。研究發(fā)現(xiàn)肥料種類顯著影響土壤中nirK反硝化細(xì)菌的豐度。施用無機(jī)肥更易促進(jìn)土壤中nirK型反硝化細(xì)菌豐度的增加，均高于綠肥配施減量化肥處理。曾希柏等[12]研究施肥對(duì)設(shè)施菜地nirK型反硝化細(xì)菌的影響，發(fā)現(xiàn)施用有機(jī)肥比單施化肥更易促進(jìn)土壤中nirK基因豐度的增加，這可能是由于施用有機(jī)肥種類的不同所導(dǎo)致。

2.5 nirK型反硝化細(xì)菌豐度和土壤性質(zhì)的相關(guān)性分析 將反硝化細(xì)菌nirK基因豐度與土壤性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析（表2），結(jié)果顯示nirK豐度與土壤性質(zhì)無顯著相關(guān)，與反硝化潛勢呈極顯著正相關(guān)（p<0.01）。Yin等[13]的研究也表明黑土中不同施肥處理的土壤反硝化潛勢與nirK基因豐度呈顯著正相關(guān)。

3 結(jié)論

在翻壓紫云英的基礎(chǔ)上，減施40%化肥是一種既節(jié)能又高效的施肥模式。翻壓紫云英配施減量化肥處理可明顯提高水稻土壤有機(jī)質(zhì)含量，同時(shí)保持土壤全氮和有效氮的含量。與單施化肥相比，綠肥配施減量化肥降低了土壤反硝化潛勢，可減少N2O排放的風(fēng)險(xiǎn)。綠肥處理中土壤nirK基因豐度顯著低于單施化肥處理。土壤nirK基因豐度與土壤反硝化潛勢呈極顯著正相關(guān)。

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（責(zé)編：張 麗）