乳清蛋白及其生物活性肽調節血糖功能研究進展

吳尚儀，李乳姝，石佳鑫，李蘭馨，曹雪妍，楊 梅，陶冬冰，岳喜慶*

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

糖尿病是一組以長期高血糖為主要特征的代謝綜合征，由于胰高血糖素缺乏和/或胰島素生物作用障礙導致糖代謝紊亂，同時伴有脂肪、蛋白質、水、電解質等代謝障礙，可并發眼、腎、神經、心血管等臟器的慢性損傷。糖尿病一般分為4 種：1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病、其他糖尿病。1型糖尿病主要是因為胰島B細胞被破壞、胰島素絕對缺乏導致，絕大多數是免疫調節性疾病；2型糖尿病主要是從以胰島素抵抗為主伴胰島素分泌不足到胰島素分泌不足伴胰島素抵抗，是一種代謝疾病，這種慢性和多因素疾病的患病率和發病率正以驚人的速度在世界范圍內不斷增加，國際糖尿病聯盟公布的第8版全球糖尿病地圖顯示，2017年全球糖尿病成人患者（20～79 歲）已達到4.25億，我國為1.144億，預計到2045年，糖尿病患者可能達到6.29億[1]；如果沒有及時的預防治療，2型糖尿病可引發嚴重的并發癥，包括心血管疾病[2]、失明[3]、腎功能衰竭[4]等。糖尿病患者典型的癥狀為“三多一少”，即多飲、多食、多尿和體質量減輕，控制能量攝入是改善糖尿病癥狀的一種手段，我國唐代著名醫學家孫思邈提出了糖尿病的運動飲食療法[5]，合理控制每日糖攝入量是預防控制糖尿病的有效手段之一。2017年新編的《AACE/ACE 2型糖尿病綜合管理指南》、《中國糖尿病膳食指南（2017）》、《國民營養計劃（2017ü2030）》中均提到通過膳食干預的方法來輔助治療糖尿病。牛乳一直被營養專家評價為最好的營養品之一，民間還有“白色血液”之稱，牛乳本身是低血糖生成指數（glycemic index，GI）食品，適合高血糖人群飲用；近年來研究表明，乳中的蛋白[6]、特定氨基酸序列[7]、游離氨基酸[8]均具有一定的調節血糖功能。乳清是奶酪或酪蛋白生產時，沉淀酪蛋白后剩余牛乳的液體部分，包含牛乳中55%的營養成分，其中乳清蛋白具有多種生物活性，可抑制飲食誘導的肥胖、葡萄糖不耐受和延遲2型糖尿病的發病[9]；因此，乳清蛋白調節血糖生物活性的研究對于輔助治療2型糖尿病、提升乳清蛋白產品附加值、開發調節血糖功能性產品都具有重要意義。國外對乳清蛋白的研究較多且較為深入，國內的研究相對較少。本文就近年來有關乳清蛋白及其生物活性肽調節血糖的研究進行綜述，希望能為未來的研究提供方向和理論借鑒。

1 乳清蛋白簡介

乳清蛋白是全價優質蛋白質，約占牛乳蛋白質的20%[10]，乳清蛋白中主要組成蛋白有β-乳球蛋白（約占50%～55%）和α-乳白蛋白（約占20%～25%）[11]，以及免疫球蛋白（約占10%～15%）、血清蛋白（約占5%）及少量乳鐵蛋白[12]，此外還含有高濃度的支鏈氨基酸亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸能夠參與機體組織的修復和更新，對各種營養和激素信號產生響應，是組織生長和修復所需的重要成分[13]。目前關于乳清蛋白的研究集中于其抗氧化、調節血糖、調節血脂、抑菌[14]、緩解肌肉減少癥[15]等功能性的研究，且基于乳清蛋白的功能已研發出了多種營養產品[16]。α-乳白蛋白和β-乳球蛋白氨基酸序列見圖1，乳清蛋白產品及其功效見表1。

圖 1 α-乳白蛋白和β-乳球蛋白氨基酸序列Fig. 1 Amino acid sequences of alpha-lactalbumin and beta-lactoglobulin

表 1 乳清蛋白產品及其功效[16]Table 1 Whey protein products and their health-promoting functions[16]

2 乳清蛋白調節血糖功能

早有學者報道攝入牛乳可一定程度降低血糖，Elmst?hl等[17]研究了食用添加牛乳的高GI白面包粉和低GI面條粉對健康人餐后血糖和胰島素反應的影響，在意大利面條粉中添加200 mL或400 mL的牛乳對志愿者葡萄糖曲線下面積沒有影響；而與輔以水相比，輔以牛奶的意大利面條餐，顯著提高了胰島素曲線下面積，即輔以牛奶較輔以水可刺激更多胰島素分泌。由此展開了對牛乳中主要調節血糖營養成分研究，其中對于酪蛋白的研究較多，目前已從牛乳中分離出具有較強生物活性的β-酪啡肽等，近年的研究逐漸集中于乳清蛋白。Jakubowicz[18]、Frid[19]等的研究均表明乳清蛋白有助于快速消化吸收碳水化合物、刺激血漿胰島素濃度升高、降低餐后血糖水平，在健康人及2型糖尿病患者中均具有促胰島素分泌作用。Olivos等[20]研究表明乳清蛋白能輔助增強降血糖藥物的藥效，乳清濃縮蛋白可增強西他列汀對二肽基肽酶-IV（dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV）的抑制活性；當乳清濃縮蛋白存在于胃腸道中時，能增強西他列汀對DPP-IV的抑制活性，從而促進胰高糖素樣肽1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）分泌，并改善血糖調節、抑制食物攝入。但有研究表明低分子質量的乳肽較未經酶解處理的乳清蛋白在體內能夠發揮更大的生物價值[21]。Gaudel等[22]分別喂食ob/ob小鼠乳清蛋白水解物與乳清蛋白8 周，喂食乳清蛋白水解物組小鼠的胰島素釋放量明顯高于喂食乳清蛋白組。對于乳清蛋白調節血糖的研究較多，初期大多數研究都基于受試者口服添加乳清蛋白食品，檢測其餐后血糖等指標；隨著調節血糖機理研究的不斷深入，檢測的指標變得更加具體全面，更利于推斷其降糖機理。

3 乳清蛋白源生物活性肽調節血糖功能

目前已從乳中不同蛋白的降解產物中篩選出多種活性肽，如具有阿片肽活性的α-酪啡肽、β-酪啡肽、γ-酪啡肽[23]等，具有降血壓活性的血管緊張素轉換酶抑制肽[24]，降膽固醇活性的IIAGLf（71～75）[25]等。大量實驗證實了乳清蛋白的不完全酶解液中存在多種功能各異的生物活性肽類，這引起了學者的關注。乳清蛋白生物活性肽是乳清蛋白經腸道消化吸收、體外酶解或微生物發酵等方式切割成肽段，其中表達生物活性的固定氨基酸序列肽段稱為乳源生物活性肽[26]。早有研究表明，乳清蛋白酶解物可通過促進葡萄糖轉運至細胞內并儲存于骨骼肌、增加促胰島素分泌激素的釋放等方式降低血糖[27]。而隨著分離鑒定合成技術的發展進步，乳中生物活性肽的分離和分析應用研究更加深入，近年來有研究表明，乳清蛋白源生物活性肽調節血糖機理包括提高胰島素敏感性[28]、抑制α-葡萄糖苷酶活性、抑制DPP-IV活性以及促進GLP-1、葡萄糖依賴性促胰島素多肽（glucosedependent insulinotropic polypeptide，GIP）、膽囊收縮素（cholecystokinin，CCK）等促胰島素釋放激素釋放[29-30]、控制血糖從而抑制食物攝入[20]、加速葡萄糖磷酸化過程進而提高體內葡萄糖代謝和利用[31]、增加腹飽感[32]等。

3.1 改善胰島素抵抗

遠端的胃、十二指腸、部分近端空腸等消化管腔黏膜上分布有大量K細胞，經食物刺激可分泌大量細胞因子-胰島素抵抗因子，導致機體對胰島素利用能力減弱，從而產生胰島素抵抗。分別喂食ob/ob小鼠乳清蛋白水解物與乳清蛋白8 周，觀察到喂食乳清蛋白水解物組小鼠血糖清除率升高，并恢復胰島素分泌的能力，周圍靶組織能夠更有效地利用胰島素，使胰島素抵抗減少，高胰島素血癥得到緩解[22]。而Morato等[33]灌胃Wistar大鼠質量分數30%葡萄糖及乳清蛋白水解物，并進行葡萄糖轉運蛋白（glucose transporter type 4，GLUT4）的Western blot分析，發現乳清蛋白水解物中L-異亮氨酸、L-亮氨酸-L-異亮氨酸可通過調節葡萄糖轉運體GLUT4表達，增加骨骼肌、脂肪組織對葡萄糖的獲取，從而改善胰島素抵抗。GLUT4是一種膜蛋白，僅存在于胰島素敏感的骨骼肌、心肌和脂肪細胞中，胰島素含量高時GLUT4轉位至膜外與葡萄糖結合，且對體外胰島素水平反應敏感，產生胰島素抵抗時這種轉運機制受阻，血糖濃度升高[34]。但相關的人體實驗較少，Turner等[35]研究食用乳制品與胰島素敏感性關系，使受試者每日攝入牛乳或相同蛋白含量的紅肉，評估增加乳制品或乳制品補充劑對糖代謝與胰島素敏感性的影響。結果表明，在8 周內兩組受試者胰島素抵抗均無明顯變化，在12～24 周之間食用高劑量乳制品組胰島素抵抗得到改善，而6 個月的干預對于胰島素抵抗無顯著影響。推測未經酶解的乳清蛋白可能不具有改善胰島素抵抗的功效，其對于改善人體胰島素抵抗的效果有待于實驗進一步驗證。

3.2 抑制α-葡萄糖苷酶活性

Lacroix等[3]研究表明，實驗中β-乳球蛋白、α-乳白蛋白水解物和α-乳清蛋白表現了一定的α-葡萄糖苷酶抑制作用。抑制α-葡萄糖苷酶是一種常見的治療糖尿病的手段，通過抑制該酶的活性能夠延緩小腸對碳水化合物的吸收，降低淀粉酶解為葡萄糖的速率，從而減緩血糖升高，達到降血糖的效果。在目前的研究中，乳清分離蛋白及其中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、乳鐵蛋白經消化道消化的水解物，均為天然來源的α-葡萄糖苷酶抑制劑[36]。

3.3 增加腸促胰素含量

20世紀80年代，研究人員發現通過不同方式口服或靜脈注射葡萄糖，當達到相同血糖水平時，口服葡萄糖較靜脈注射方式可促進更多胰島素分泌，由此也證實了小腸分泌的物質具有促進胰島素分泌的功能，此物質后被定義為腸促胰素，屬于葡萄糖依賴型促胰島素分泌劑，即不會引起低血糖的癥狀；但其在血液中易被DPP-IV水解，在體內的半衰期僅為2 min，若可增加腸促胰素的含量或抑制DPP-IV的活性，則可促進胰島素的分泌，進而調節血糖水平[37]。乳清蛋白通過胃腸道消化過程中產生的生物活性肽和氨基酸可刺激CCK、腸抑素胃抑制肽和GLP-1等胃腸激素的釋放，從而促進細胞的胰島素分泌，調節食物攝取。乳清蛋白源生物活性肽也可作為近端腸內DPP-IV的內源性抑制劑，減少腸促胰素降解[18]。

通過檢測C肽來反映胰島素應答，證實了腸促胰素效應的存在；腸促胰素包括GLP-1、GIP兩種，其作用于胰島β細胞，增強葡萄糖依賴的胰島素分泌，可減少肝糖原的輸出，增加飽腹感，能起到一定的減肥作用[18]。在體內GLP-1易被DPP-IV降解滅活，半衰期約為2 min[38]。DPP-IV底物為內源性腸促胰素，腸促胰素減少會導致β細胞敏感性降低、功能衰退。DPP-IV抑制劑是一種新型調節血糖藥物，屬于促胰島素合成與分泌類降血糖藥物，通過抑制DPP-IV對GLP-1的水解，增強GLP-1的活性，從而促進胰島素的合成與分泌，達到調節血糖的作用[20,39-40]。DPP-IV抑制肽氨基酸序列對其活性影響顯著，具有抑制活性的肽段通常包含支鏈氨基酸，N端或P1位的脯氨酸殘基側鏈帶有極性基團的芳香族殘基，C端的氨基酸也有一定影響，通過運用動態分析法及分子對接模型，發現不同的肽段對酶的抑制行為不同，包括競爭、非競爭及混合行為，早期的研究表明具有Xaa-Pro、Pro-Xaa、或Xaa-Ala結構（Xaa表示所有氨基酸）的二肽對酶的抑制行為通常為競爭性[7]。

表 2 乳清蛋白水解物中DPP-IV抑制活性肽[7,43,45]Table 2 DPP-IV inhibitory peptides from whey protein hydrolysates[7,43,45]

Gillespie等[41]利用胰島內分泌（enteroendocrine，EE）細胞模型，研究了乳清、乳清蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白及其水解物對EE細胞模型及對GLP-1、GIP分泌的影響，結果表明，乳清蛋白中的β-乳球蛋白可刺激EE細胞增殖和GLP-1的分泌，促進胰島素的合成和胰島素在β細胞中的儲存，還可促進前體細胞向β細胞分化，導致β細胞增殖，減少胰島細胞凋亡，保護β細胞免于功能障礙/破壞。16 名成年健康男子攝入乳清蛋白水解物，發現其促進了胰島素分泌，且機理與胃排空無關[42]。GLP-1的分泌活性在被蛋白水解酶水解后喪失或顯著降低，α-乳白蛋白是一種強效GLP-1促分泌劑，能夠增加細胞內GLP-1水平，實驗結果顯示乳清蛋白及其水解物對GIP分泌影響不大[9,41]。Silveira等[43]用富含β-乳球蛋白的濃縮乳清蛋白經胰蛋白酶水解、分離、純化，鑒定出DPP-IV抑制肽和IPAVF，測定其半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為44.7 μmol/L。Tulipano等[44]分離得到最佳降糖肽的序列為Ile-Pro-Ala，利用固相合成得到的該肽段進行實驗，發現其在一定程度上可以抑制DPP的活性。眾多研究表明乳是DPP-IV抑制肽很好的天然來源[7]，其中的α-乳清蛋白及β-乳球蛋白是最主要的DPP-IV抑制肽來源，其水解物中分離純化出多種DPP-IV抑制活性肽（表2）[7,43,45]。乳清蛋白源的肽可作為功能性食品成分用于調節血糖水平，但目前對于腸促胰素的釋放、膜的去極化、鈣敏感受體[46]、G蛋白偶聯受體的激活刺激cAMP的產生[47]等機制研究尚不深入，活性肽結構與功能特性之間的關系還缺乏相應的研究，其在體內遞送途徑、生物利用率仍不明確。DPP-IV不僅能發揮蛋白酶的作用，還具有活化、增殖T細胞的功能，且底物除了腸促激素外還有一些神經肽、生長因子，而目前在體內未發現DPP-IV的抑制劑，但相關人體實驗較少，尚未發現有相應副作用。常見的DPP-IV抑制劑或GLP-1促進劑的代謝器官為肝臟或腎臟，而乳清蛋白酶解物對于人體器官的損傷作用及可能引起的副作用需要進一步研究確認[48]。

3.4 其他影響

肥胖，尤其是內臟性肥胖是2型糖尿病、高血壓和血脂紊亂等代謝異常疾病較嚴重的危險因子。內臟脂肪比周圍脂肪細胞對胰島素代謝作用更抵抗，且對脂激素更敏感；內臟肥胖使游離脂肪酸釋放進入門靜脈的含量增加，從而增加甘油三酯濃度，損害了胰島素的首過代謝效應；DPP-IV抑制劑類藥物較磺脲類、GLP-1促進劑類藥物可以改善血糖調節，并有希望治療肥胖癥[18]。肥胖受試者攝入乳清蛋白水解物可減少其對能量的攝入，但能量攝入量仍高于正常受試者，兩者的能量攝入依賴于蛋白至小腸的運輸率，且與GLP-1、胰島素、胰高血糖素等激素的濃度呈負相關[49]；另一方面，在人體實驗中已證實消化、吸收、代謝乳清蛋白所消耗的能量高于碳水化合物或脂肪，餐后產熱較碳水化合物或脂肪更多，且乳清蛋白較酪蛋白或大豆蛋白組成的蛋白質會產生更大的熱原反應[50]。

乳清蛋白及其生物活性肽對能量攝入的調節與調節血糖水平存在一定聯系。Hutchison等[49]分別選取了12 位無糖尿病的正常身材男性和肥胖男性，并分別對其十二指腸輸注乳清蛋白水解物，研究其CCK、GLP-1、GIP等激素分泌情況。結果表明，肥胖受試者血清中CCK、GLP-1、GIP、胰島素、胰高血糖素水平與十二指腸中乳清蛋白水解物劑量呈正相關，而能量的攝入水平與上述激素分泌情況呈負相關。在攝入乳清蛋白的年輕受試者中，性別與能量攝入之間具有相關性，年輕女性的能量攝入低于年輕男性，可能由于蛋白質在年輕女性中的飽腹感低于年輕男性[51-52]，但老年人的性別差異對能量攝入影響不明顯[53]。

4 結 語

乳清蛋白及其生物活性肽具有調節血糖、消除氧自由基、提高谷胱甘肽抗氧化水平等作用，且已有學者提出水解乳清蛋白可能成為新型糖尿病治療藥物。對于糖尿病小鼠，飲食補充乳清蛋白可增強創傷愈合過程中正常的炎癥反應，有助于恢復氧化應激和炎性細胞因子水平，減少糖尿病并發癥的發生；對于飲用乳清蛋白強化發酵乳品人群，其可以提高抗肥胖作用，抑制脂肪合成、減少氧化應激[54]。此外，乳清蛋白調節血糖的效果一般不如乳清蛋白源生物活性肽，但后者的制備成本較高，急需尋找一種高效、快捷、適合工業化生產的制備方法。對于乳清蛋白及其生物活性肽中必需氨基酸的研究已較為深入，目前對乳清蛋白中非蛋白氨基酸組成含量及其構效關系的研究較少，非蛋白氨基酸在生物體的新陳代謝、生殖發育、信息傳遞等生理過程中發揮著重要作用，且具有抗酶解的能力，未來可結合同位素相對標記與絕對定量技術等檢測手段，研究乳清蛋白及其酶解物中非蛋白氨基酸的組成、含量及其對調節機體血糖的影響。

由于調節血糖的機理較為復雜，目前對于乳清蛋白的研究集中于改善胰島素抵抗、抑制α-葡萄糖苷酶活性、增加腸促胰素含量等方面，對乳清蛋白及其生物活性肽調節血糖的機理尚未探尋清楚，對于其代謝組學、通路研究等機理研究較少。隨著研究的深入，乳清蛋白生物學功能及其機理必會得到進一步明確。目前研究對象的選擇較全面，覆蓋孕期婦女、老年患病者等特殊人群，但多數實驗周期較短，結果缺乏中長期實驗驗證。

通過對乳清蛋白及其調節血糖生物活性肽的降糖功效的綜述，有望為輔助治療2型糖尿病、提升乳清蛋白的生物利用率、提供乳源調節血糖功能產品的研發等方面提供新的思路。