基于先進材料的適配體傳感器在真菌毒素快速檢測中的研究進展

王嫦嫦，馬 良*，劉 微，郭 婷，譚紅霞，張宇昊,3，周鴻媛，陳 露，李道亮

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.武漢市農業科學院環境與安全研究所，湖北 武漢 430207；3.西南大學前沿交叉學科研究院生物學研究中心，重慶 400715）

真菌毒素是由產毒真菌在特定條件下產生的一類具有生物活性的次生代謝產物。按其產毒菌種可分為曲霉菌毒素、青霉菌毒素和鐮刀菌毒素等幾大類[1-3]。聯合國糧食及農業組織2014年—2016年從近150 個國家收集的數據表明，全球有超過27.4%的農產品被真菌毒素污染[4]。目前，已知真菌毒素有400多種，對人畜危害較大的有曲霉菌屬產生的黃曲霉毒素（aflatoxins，AF）和赭曲霉毒素A（ochratoxin，OTA），鐮刀菌屬產生的玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、伏馬毒素B1（fumonisin B1，FB1）和T-2毒素，青霉菌屬產生的展青霉素（patulin，PAT）以及麥角堿等。

現階段，真菌毒素定量檢測技術主要采用色譜法[5-6]和免疫測定法[7-8]。色譜法可對真菌毒素進行精準定量，但要求專業人員操作，操作步驟繁瑣且經濟成本相對較高。免疫測定法檢測靈敏度高，已廣泛用于真菌毒素檢測中，但特異性抗體的質量和較為苛刻的儲存條件等一直是制約其應用的關鍵問題。近年來，新興的化學抗體-適配體作為抗體識別的替代物，逐漸成為真菌毒素檢測領域的研究熱點。

適配體也叫核酸適配體、適體，是通過指數富集配體系統進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術體外人工篩選得到的單鏈寡核苷酸或肽（通常是DNA或RNA），長度一般為25～60 個堿基[9-11]。適配體具有高親和力與特異性，更易化學合成、改造與標記等優點，目前常被用作分子識別元件。當配體物質存在時，其可以在芳香環堆疊、靜電、范德華力和氫鍵等的作用下，自身折疊形成如假結、發卡、G-四分體、凸環等三維空間結構來識別和結合靶分子[12-14]。近年來，適配體技術在臨床[15-16]、醫療[17]以及食品檢測[18-20]等領域發展迅速。本文概括了近10 年來文獻報道的主要真菌毒素適配體，并對基于先進材料的適配體傳感器在真菌毒素快速檢測中的應用進展以及現階段存在的主要問題進行了綜述。

1 常見真菌毒素的適配體

篩選具有高親和力和高特異性的適配體是構建基于適配體的真菌毒素生物傳感平臺的關鍵。近年來，研究者們利用SELEX程序已經篩選到了許多真菌毒素的適配體。表1列舉了近10 年來文獻報道的AF、OTA、ZEN、DON、FB1、PAT、T-2毒素等真菌毒素的適配體序列。

表 1 真菌毒素的適配體Table 1 List of mycotoxin aptamers

1.1 AF的適配體

Pociecha等[38]于2011年篩選得到了AFB1的適配體（表1中AFB1的第一條適配體）。在隨后幾年，Ma Xiaoyuan等[22-23]將磁性納米粒子分別作為AFB1和AFB2的載體，利用SELEX技術先后篩選了AFB1和AFB2的適配體（表1）；其中，AFB1的適配體與AFB2、AFG1、AFG2、OTA和FB1之間的結合不超過15%，AFB2的適配體與AFB1、AFG1、AFG2、OTA和FB1之間的結合不超過18%，均表現出良好的特異性。Malhotra等[24]使用層壓磁（magnetic beads，MBs）作為AFM1的載體，篩選得到包含兩個重疊莖環這種獨特結構的AFM1適配體AFAS3（表1），但其特異性測試結果表明適配體AFAS3與AFB1具有約25%交叉反應率。到目前為止，篩選到的AF適配體主要集中在AFB1、AFB2和AFM1上，其他類型的AF（G1、G2和M2）適配體鮮見報道，仍需開發新的篩選制備技術，提高AF適配體的篩選效率，同時對現有適配體研究進一步提高其特異性。

1.2 OTA的適配體

2008年Cruz-Aguado等[39]基于親和柱的SELEX技術篩選到了OTA的適配體1.12，該序列中鳥嘌呤的含量高達47%，表明其很有可能折疊為G-四分體。隨后，Barthelmebs等[27]篩選了OTA的適配體H12（表1），并證實了雖然H12與1.12具有兩個共同的序列（GGGTGTGGG和AGGGAGT），存在典型的結構相似性，但篩選條件完全不同，適配體H12具有最高的靈敏度和特異性。近年來，McKeague等[29]篩選到了OTA的適配體A08和包括排除引物區的A08截短部分（A08min）（表1），并基于該適配體構建了熒光測定法，以快速、高靈敏地檢測OTA（檢出限為9 nmol/L）。對這些文獻進行分析，現階段已篩選出的OTA適配體序列均富含G且應用相對較成熟，這與靶標物OTA與富含G的序列結合會促進G-四分體的形成有關。

1.3 其他真菌毒素的適配體

Chen Xiujuan等[40]基于MBs的SELEX技術篩選出ZEN的適配體8Z31（表1中ZEN的第一條適配體）。Wang Yuankai等[31]將純化的ZEN單克隆抗體包被在微量板上作為被單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA）文庫識別的靶標物，通過生物素-鏈霉親和素間相互作用篩選出對ZEN具有高親和力和特異性的適配體（表1），對AFB1、FB1和DON的交叉反應率均低于0.01%。此外，Eifler等[32]通過親和柱的SELEX技術篩選到了DON的適配體C8（表1），但其并未將該適配體C8用于實際樣品中DON的定量測定，僅僅只是利用電子鼻技術對DON污染的谷物進行區分（精度約為80%），故未來仍需進一步開發新的檢測方法來提高適配體C8的利用率。

FB1適配體（FB139）是由McKeague等[41]利用MBs-SELEX技術篩選到的（表1中FB1的第一條適配體），該適配體FB139含有96 個堿基，序列較長。隨后，Frost等[42]在McKeague等[41]的研究基礎上，將適配體FB139截短，得到了相似親和力的FB139的最小值序列（FB1_39t3和FB1_39t3-5）（表1）。Chen Xiujuan等[33]使用改進的SELEX技術篩選了FB1適配體F10，與FB139（Kd＝（100f30）nmol/L）相比，適配體F10（Kd＝（62f5）nmol/L）對目標物FB1具有更高的親和力。目前除了FB1，其他FB的適配體還鮮見報道。因此，未來仍需進一步擴大其選擇范圍，并對已經篩選到的FB1適配體進行改造來提高其親和力。

Wu Shijia等[34]使用氧化石墨烯-SELEX（graphene oxide-SELEX，GO-SELEX）法篩選到PAT的高親和力適配體PAT-11（解離常數低至（21.83f5.02）nmol/L），這是利用以GO可通過π-π共軛吸附游離的ssDNA而不吸附與靶標物結合的DNA的特性為基礎進行的篩選。Tomita等[35]建立DNA模塊平臺結合計算機中的二級結構預測，成功篩選了一種PAT的新型適配體（表1），并開發出相應微陣列-適配體傳感器測定PAT。

Chen Xiujuan等[36]利用GO-SELEX法制備出特異性結合T-2毒素的高親和力適配體Seq.16（表1），研究T-2毒素結合Seq.16形成的發夾結構的A型雙鏈體，開發了相應的啤酒中T-2毒素的熒光定量檢測技術。

Rouah-Martin等[37]將兩種麥角堿（麥角胺和甲麥角林）固定在MBs上，從ssDNA文庫中分離出與麥角堿結合的DNA，并用猝滅的MBs進行逆選擇消除非特異性結合的適配體，最終篩選出具有兩個共同C堿基序列的麥角堿適配體M3.2（表1），并證實該適配體M3.2存在兩個結合位點，能夠區分測試不同的麥角堿，但其特異識別作用局限于具有麥角靈環并且尺寸小于甲麥角林的分子。

目前OTA、AF適配體的篩選相對較成熟，基于已篩選的適配體已經構建了包括熒光測定法、比色法和電化學法在內的多種分析檢測方法，以實現OTA、AF的高靈敏、高選擇性測定。其他真菌毒素的適配體在應用范圍、穩定性與親和力等方面仍需加強研究。此外，用于不同種類、不同形態（結合態、衍生物等）真菌毒素共同檢測的適配體序列研究較為欠缺。

2 基于先進材料的適配體傳感器在真菌毒素快速檢測中的應用

適配體傳感器是以適配體作為分子識別元件，通過與靶標物的特異性作用，從而引起直接或間接的信號變化，最終實現對靶標物檢測的一類傳感器[43-44]。根據信號轉換方式的不同，可將其分為：熒光適配體傳感器、比色適配體傳感器、表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）適配體傳感器、電化學適配體傳感器和電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）適配體傳感器。金納米粒子（Au nanoparticles，AuNPs）、石墨烯和石墨烯納米復合物、量子點（quantum dots，QDs）以及磁性納米粒子等先進材料具有優異的生物相容性、光學性能、機械性能和導電性能，應用于適配體傳感器中可縮短樣品準備和實驗檢測時間，極大地提高檢測靈敏度，因此，被深入研究并廣泛應用于真菌毒素的定量檢測。

2.1 基于先進材料的熒光適配體傳感器

熒光適配體傳感器主要是測量適配體與靶標物作用所引起的熒光信號變化[45]。作為識別元件的適配體很容易被先進材料吸附，在真菌毒素檢測領域研究和應用得越來越廣泛。

Ma Liang等[46]報道了基于DNA酶I輔助目標循環信號放大策略的磁性還原氧化石墨烯（rGO-Fe3O4）的PAT熒光測定法。利用rGO-Fe3O4納米材料對PAT適配體的吸附和保護作用，使DNA酶I只作用（切割）游離的適配體-PAT復合物，不斷釋放到體系中的PAT可以開始下一個靶標物循環過程，從而觸發更多的適配體切割，這種DNA酶I輔助靶標物的再循環可顯著提高PAT的熒光強度和檢測靈敏度，其檢測限可低至0.28 μg/L，比未使用該策略時的靈敏度提高約13 倍。且該傳感器已成功用于蘋果汁（加標回收率：77.34%～96.65%）和葡萄汁（加標回收率：97.14%～103.89%）中PAT的檢測。

Sabet等[47]開發了用于AFB1檢測的熒光適配體傳感器。在該體系中，QDs和AuNPs分別作為供體和受體，通過適配體與AuNPs的靜電作用，QDs-適配體被吸附在AuNPs的表面，導致熒光猝滅；引入AFB1后，QDs-適配體與AFB1結合并形成QDs-適配體-靶標復合物，從而遠離AuNPs表面，QDs的熒光得以恢復。在最優條件下，該傳感器的檢出限為3.4 nmol/L，線性范圍為10～400 nmol/L，對常見的干擾物AF（B2、G1、G2和M1）顯示出良好的特異性，并已成功地應用于大米（加標回收率：103%～108%）和花生（加標回收率：104.5%～108.0%）樣品中AFB1的分析。

Hu Shuisheng等[48]基于制備的新型納米復合材料（Fe3O4/g-C3N4/HKUST-1）的熒光猝滅能力，開發了用于玉米中OTA測定的熒光適配體傳感器。復合材料Fe3O4/g-C3N4/HKUST-1能夠通過光電子傳遞機制猝滅染料的熒光，在加入靶OTA后，其可以高特異性地結合染料標記的適配體，導致適配體遠離Fe3O4/g-C3N4/HKUST-1，體系的熒光恢復。該傳感器的檢出限為2.57 ng/mL（RSN為3），線性范圍為5.0～160.0 ng/mL，且在玉米樣品中OTA的加標回收率為96.5%～101.4%，相對標準偏差為4.5%～5.6%。

Zhang Jing等[49]報道了一種可同時檢測OTA和AFB1的熒光適配體傳感器（圖1）。固定在MBs表面的OTA適配體（Ap1）和AFB1適配體（Ap2）分別與信號探針1（Sp1）和信號探針2（Sp2）雜交以形成Aps-Sps雙鏈體結構。由于毒素靶標物-Aps的穩定性要高于Aps-Sps雙鏈體結構，OTA和AFB1存在時，分別與相應的Aps結合形成G-四分體和AFB1-Aps復合物，并釋放Sp1和Sp2，磁分離后，釋放的Sps合成具有不同光致發光帶的DNA支架-銀納米顆粒，利用Zn（II）使熒光強度顯著增強。該傳感器的熒光強度與OTA和AFB1的質量濃度（0.001～0.050 ng/mL）呈良好的線性關系，且OTA的檢出限為0.2 pg/mL，AFB1的檢出限為0.3 pg/mL，在小麥、大米和玉米樣品中，OTA的加標回收率為（88.50f6.90）%～（113.50f5.30）%，AFB1的加標回收率為（88.10f5.70）%～（116.80f4.90）%。該方法的開發為同時檢測更多類型的真菌毒素開辟了一條新途徑。總地來說，基于先進材料的熒光適配體傳感器作為一種新型的檢測方法具有靈敏度高、耗時短等特點。

圖 1 用于OTA和AFB1測定的熒光適配體傳感器[49]Fig. 1 Fluorescence aptasensor for the determination of ochratoxin (OTA)and fumonisin B1 (AFB1)[49]

2.2 基于先進材料的比色適配體傳感器

比色適配體傳感器構建通常涉及納米材料和用于信號放大的DNA酶[50]。Seok等[51]基于DNA酶-血紅素/適配體復合物開發了AFB1誘導DNA酶結構變化的比色傳感器。在該體系中（圖2），兩個裂解的DNA酶（α和β）與AFB1適配體的互補區域雜交形成G-四分體，并在血紅素存在時，在H2O2的催化作用下氧化2,2’-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）產生有色陰離子自由基。當AFB1存在時，適配體特異性識別AFB1導致DNA酶-血紅素/適配體復合物的解離，產生肉眼可見的顏色變化。該傳感器的線性范圍為0.1～1.0h104ng/mL，檢測限為0.1 ng/mL，在玉米樣品中AFB1的加標回收率為93.96%～104.95%且穩定性良好（相對標準偏差小于6%）。

Yang Cheng等[52]開發了以AuNPs為指示劑的OTA比色適配體傳感器（圖3）。不存在OTA時適配體被吸附到AuNPs的表面，可提高AuNPs對鹽誘導聚集的穩定性。當體系中存在靶標物OTA時，OTA結合適配體，使適配體的構象從無規卷曲結構變為反平行G-四分體結構，并從AuNPs表面解離，失去對AuNPs的保護作用。而在體系中加入鹽后，會導致AuNPs的聚集，故可通過肉眼監測溶液從紅色到藍色的顏色變化來實現OTA的定量檢測。該比色適配體傳感器的線性范圍為20～625 nmol/L，檢出限為20 nmol/L，且操作方便、快捷，整個操作過程只需5 min。比色適配體傳感器可通過肉眼觀測到的顏色變化來實現真菌毒素測定，尤其適合現場快速篩查，但靈敏度仍有待進一步提高。

圖 3 基于OTA適配體和未修飾的AuNPs的比色適配體傳感器[52]Fig. 3 Schematic illustration of colorimetric aptasensor utilizing OTA aptamer and unmodified AuNPs[52]

2.3 基于先進材料的SPR適配體傳感器

SPR適配體傳感器通常是將具有特異性識別能力的分子即適配體固定于傳感片表面，通過監測靶標物與傳感片表面的適配體結合導致的折射率變化，來實現靶標物的快速和實時定量分析[53-54]。

Sun Linlin等[55]開發了一種新型的SPR適配體傳感器定量分析AFB1。該體系中（圖4），適配體作為親和配體固定在SPR傳感器芯片上。當AFB1時存在，AFB1與適配體結合，產生顯著的SPR響應，SPR信號隨著AFB1濃度增加而增強。在最佳條件下，該SPR適配體傳感器的檢出限低至0.4 nmol/L，并可用于復雜樣品基質（在稀釋100 倍的紅葡萄酒和稀釋50 倍的啤酒中AFB1的加標回收率為87%～102%）中AFB1的定量測定。該芯片具有良好的重復性和穩定性，4 ℃下儲存80 d后，芯片仍可對AFB1作出良好響應。該方法簡便快速、節省試劑，且具有高靈敏度，表現出良好的應用潛力。

圖 4 用于AFB1測定的SPR適配體傳感器[55]Fig. 4 Surface plasmon resonance aptasensor for AFB1 determination[55]

Zhu Zhiling等[56]開發了用于OTA檢測的SPR適配體傳感器。將鏈霉親和素固定在傳感器芯片的表面上，通過鏈霉親和素-生物素之間的強相互作用捕獲生物素修飾的OTA適配體，在加入OTA后，OTA與適配體的特異性結合導致SPR信號的改變，通過直接測量最小反射強度的角度（與OTA質量濃度成正比）來實現OTA的定量測定。該傳感平臺的線性范圍為0.094～10.000 ng/mL，檢出限低至0.005 ng/mL，并已成功的用于葡萄酒（加標回收率：86.92%～116.54%）和花生油（加標回收率：87.76%～108.59%）中OTA的檢測。該SPR適配體傳感器無需標記，可實時進行高靈敏檢測，實現了樣品制備技術的簡化。

2.4 基于先進材料的電化學適配體傳感器

電化學適配體傳感器是通過生物識別元件-適配體和目標分析物之間的生物化學反應來評估電參數（例如電流、阻抗、電導率、電壓或電位信號）變化的傳感平臺[57]。設備簡單、靈敏度高、易微型化，一直是分析工作者的重點研究對象[58-59]。近年來，結合先進材料的電化學適配體傳感器由于可以克服原有傳感器檢測方法中選擇性差、靈敏度低等缺陷而蓬勃發展。

Sun Aili等[60]利用GO-適配體和DNA酶I輔助OTA循環信號放大，開發出一種均相電化學檢測法。硫堇標記的OTA適配體通過非共價作用附著在GO表面，形成的硫堇-適配體/GO納米復合物懸浮在檢測溶液中，產生較弱的電信號。當體系中存在靶標物OTA時，OTA與適配體反應形成硫堇-適配體/OTA復合物，電信號得以增強，DNA酶I可作用（切割）新形成的復合物并釋放靶標物OTA，使其可以開始下一個靶標物循環過程，從而觸發更多的適配體切割。該檢測平臺電化學響應良好，檢出限低至5.6 pg/mL，檢測小麥樣品時的準確度與商業化的酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒相當，能滿足OTA的高靈敏測定。但是該方法耗時長（形成的硫堇-適配體/OTA復合物從GO的表面脫離需要90 min），限制了其應用。

Wang Chengquan等[26]將包被CdTe-QDs或PbS-QDs的二氧化硅分別標記OTA和FB1的特異性適配體，用Fe3O4@Au MBs固定相應適配體的互補DNA作為捕獲探針，開發了可同時檢測OTA和FB1的磁控電化學適配體傳感器（圖5）。OTA和FB1存在時，適配體優先與靶標物形成適配體-靶標復合物，使標記物遠離MBs表面。經過一步培養和簡單的磁分離后，通過峰電位的差異來測定與靶標物濃度呈負相關的標記物中所溶解Cd2+和Pb2+的信號。OTA的線性范圍為10 pg/mL～10 ng/mL，檢出限為5 pg/mL，FB1的線性范圍為50 pg/mL～50 ng/mL，檢出限為20 pg/mL。檢測玉米樣品時，OTA的加標回收率為85.0%～94.2%，FB1的加標回收率為92.0%～103.0%。該傳感器具有儀器簡單、樣品用量少、檢測時間短等優點，且能夠通過不同的金屬硫化物-QDs同時檢測多種真菌毒素，為真菌毒素的快速篩選提供了新途徑。

圖 5 檢測OTA和FB1的磁控電化學適配體傳感器[26]Fig. 5 Magneto-controlled aptasensor for simultaneous electrochemical detection of OTA and

2.5 基于先進材料的ECL適配體傳感器

ECL適配體傳感器同時具備化學發光技術和適配體傳感器的優點，能極大地提高檢測的靈敏度，已成為適配體傳感領域一個重要的研究方向[61]。

Zhao Yuan等[62]利用離子銥（Ir）絡合物良好的電化學發光效率和AuNPs較大的比表面積、優異的導電性，開發了用于FB1高靈敏測定的AuNPs-Ir驅動的電化學發光適配體傳感器，檢出限低至0.27 ng/mL，并已成功的用于小麥樣品中FB1的測定，加標回收率為97.6%～107.5%。Yang Mengli等[63]基于QDs-ECL和核酸外切酶輔助OTA循環信號放大，開發了一種高靈敏的ECL適配體傳感器（圖6）。在該體系中，當不存在OTA時，生物素修飾的適配體會和固定在修飾了CdTe-QDs電極表面的cDNA雜交形成雙鏈DNA，并通過鏈霉親和素-生物素之間的強相互作用捕獲鏈霉親和素修飾的堿性磷酸酶，在電位掃描期間，CdTe-QDs會和堿性磷酸酶產物的電氧化物質之間發生電子轉移，導致低的ECL響應。當存在OTA時，OTA與生物素-適配體的特異性結合使其遠離電極表面，電子轉移被抑制，ECL信號得以增強，核酸外切酶可作用（切割）新形成的復合物并釋放靶標物OTA，使其可以開始下一個靶標物循環過程，從而觸發更多的適配體切割。該傳感器靈敏度高（檢出限低至0.64 pg/mL）、選擇性強，測定紅葡萄酒中的OTA（加標回收率為96%～110%）時，與商業化ELISA試劑盒（加標回收率為94%～112%）的檢測結果具有良好的一致性。ECL適配體傳感器在電化學適配體傳感器的基礎上進一步提高了檢測的靈敏度和選擇性，在真菌毒素檢測領域具有良好的應用前景。

圖 6 基于QDs-ECL和核酸外切酶輔助OTA循環信號放大的ECL適配體傳感器[63]Fig. 6 Electrochemiluminescence aptasensor based on QDs-ECL and exonuclease-assisted OTA cycle signal amplification[63]

3 結 語

適配體所具有的特異性識別作用使其在用于真菌毒素測定的基于先進材料的傳感器中格外具有吸引力。然而，目前仍有很多真菌毒素缺乏適配體，需進行大量真菌毒素的適配體篩選工作，完善真菌毒素適配體序列庫；已篩選到的真菌毒素適配體在親和力、特異性以及批次間的穩定性方面存在著不足，可以提出或修訂一些適配體重點評價指標來評價和篩選適配體，且目前在真菌毒素檢測應用報道中，大多已有序列在個別特定方法中表現良好，僅有少數適配體序列適用性比較強，成為研究者應用的“重點”序列，未來可以提出一些“重點”適配體的應用構型，進一步提高適配體的篩選效率和適用性。通過對文獻的整理，分析和總結了現階段各種基于先進材料的適配體傳感器在真菌毒素檢測領域存在的優缺點及應用現狀（表2），基于先進材料的適配體傳感器在真菌毒素快速檢測方面的應用具有快速、高靈敏度和高特異性等優勢，也存在穩定性差、開發難度大等方面的限制，未來應加強多種真菌毒素同時測定，尤其是真菌毒素現場實地檢測中的應用開發。高靈敏度真菌毒素傳感器及傳感體系、小型便攜式的商業快檢設備和速測產品將是食品或農產品中多種真菌毒素檢測的兩大熱點發展趨勢方向。此外，未來可以考慮如何篩選和利用序列來實現不同種類、不同形態的真菌毒素檢測。

表 2 基于先進材料的真菌毒素適配體傳感器Table 2 Aptasensor for mycotoxin detection based on smart materials