響應面法優化云南美味牛肝菌總黃酮的提取工藝研究

郭磊，尹須，加依達爾·努爾哈買提，岳家夢，華燕，闞歡

(1.西南林業大學 生命科學學院，昆明 650224; 2.西南林業大學 云南森林資源培育與利用協同創新中心，昆明 650224)

美味牛肝菌(BoletusedulisBall. ex Fr)又名大腳菇、網紋牛肝菌等，因外形酷似牛肝而得名，是世界著名的食藥用野生菌之一，號稱“牛肝菌之王”[1]。中國是美味牛肝菌的主要分布區域，主要分布于河南、四川、云南、內蒙古、福建和陜西等地[2，3]。美味牛肝菌不僅富含蛋白質、氨基酸、維生素等多種營養素[4]，而且風味獨特，是制備天然化、營養化復合調味料的優質原材料[5，6]。另外，黃酮類化合物廣泛存在于天然產物中，是一類具有2-苯基色原酮結構的化合物[7]，具有顯著的抗氧化功效，可以防治多種慢性疾病[8]，在調味食品和保健食品中也有一定的應用。

目前，對美味牛肝菌的營養成分及活性成分如多糖的研究較多[9]，但對于黃酮的相關研究鮮有報道。黃酮不僅是美味牛肝菌的主要活性物質，也是制備功能性調味料的主要成分，所以對于美味牛肝菌黃酮的研究就顯得尤為重要。提取總黃酮的方法主要是乙醇浸提法[10，11]，因此，本研究采用乙醇浸提法提取美味牛肝菌總黃酮，并通過響應面優化試驗建立總黃酮提取工藝的數學模型，獲得最優的總黃酮提取工藝參數，為美味牛肝菌總黃酮的制備及進一步開發出功能性調味料提供一定的技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

美味牛肝菌：云南易門縣康源菌業有限公司；蘆丁標準品：上海源葉科技有限公司；95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉：以上均為分析純試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的制作

參考劉蕓等的方法并略微修改[12]。準確配制0,0.04,0.08,0.12,0.16,0.20,0.24,0.28,0.32,0.36，0.4 mg/mL的蘆丁標品溶液1.00 mL，用70%乙醇定容至2.0 mL，然后分別與5% NaNO2溶液、10% Al(NO3)3溶液和4% NaOH溶液混合搖勻，靜置后在510 nm波長處測定吸光值。以蘆丁標品的濃度(C)為橫坐標，以吸光值(A)為縱坐標，得標準曲線的回歸方程為：A=1.2666C-0.0055,R2=0.9984。

1.2.2 總黃酮提取率的計算

準確吸取1.00 mL 美味牛肝菌提取液與1.00 mL無水乙醇混勻后，按照1.2.1標準曲線的制作方法測定吸光值，推算出美味牛肝菌提取液中總黃酮的提取率。

提取率=[(C×V×n)/(m×1000)]×100%。

(1)

式中：C為美味牛肝菌提取液中總黃酮的濃度，mg/mL；V為美味牛肝菌提取液的體積，mL；n為稀釋倍數；m為美味牛肝菌的質量，g。

1.2.3 美味牛肝菌總黃酮的提取

1.2.3.1 單因素試驗

云南美味牛肝菌子實體經干燥、粉碎過篩后備用。以總黃酮提取率為試驗指標，采用單因素試驗，探究液料比(mL/g)、提取溫度(℃)、乙醇濃度(%)、提取時間(min)及提取次數對云南美味牛肝菌總黃酮提取量的影響。影響總黃酮提取率的因素設以下水平：固定提取溫度80 ℃，乙醇濃度70%，時間90 min，提取2次，考察不同的液料比(15，20，25，30，35，mL/g)對總黃酮提取率的影響；固定液料比25(mL/g)，乙醇濃度70%，時間90 min，提取2次，考察不同提取溫度(65，70，75，80，85 ℃)對總黃酮提取率的影響；固定液料比25 (mL/g)，提取溫度75 ℃，提取時間90 min，提取2次，考察不同乙醇濃度(60%、65%、70%、75%、80%)對總黃酮提取率的影響；固定液料比25 (mL/g)，提取溫度75 ℃，乙醇濃度70%，提取2次，考察不同提取時間(60，90，120，150，180 min)對總黃酮提取率的影響；固定液料比25 (mL/g)，提取溫度75 ℃，乙醇濃度70%，提取時間120 min，考察不同提取次數(1，2，3 次)對總黃酮提取率的影響。

1.2.3.2 響應面優化試驗

在單因素試驗結果的基礎上，選擇對云南美味牛肝菌總黃酮提取率影響較大的4個因素(液料比、提取溫度、乙醇濃度和提取時間)，每個因素選取3個水平，根據Box-Behnken響應面設計原理，以總黃酮提取率為指標，因素水平設置見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test

使用數據分析軟件Design-Expert 8.0.6進行數據分析，通過F檢驗對試驗數據進行方差分析以評價模型的統計意義并進行驗證試驗。

2 結果與分析

2.1 響應面法優化美味牛肝菌總黃酮的最佳提取條件

2.1.1 響應面回歸模型的建立及分析

在單因素試驗結果的基礎上，以總黃酮提取率為響應值，選擇影響總黃酮提取率的4個因素液料比、提取溫度、乙醇濃度和提取時間為自變量，建立4因素3水平中心組合試驗設計，結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiment

采用Design-Expert 8.0.6對所得數據進行回歸分析，回歸結果分析見表3，對4個因素進行回歸擬合后，得到回歸方程：

Y=2.61+0.19X1+0.21X2-0.044X3-0.084X4+0.058X1X2-0.015X1X3+0.19X1X4-0.012X2X3-0.22X2X4+0.021X3X4-0.28X12-0.022X22-0.15X32-0.44X42。

(2)

由方差分析表3可知，該回歸方程模型顯著(P<0.05)，失擬項不顯著(P>0.05)，說明該模型與實際擬合良好，并且所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小，可用該回歸方程代替試驗點對試驗結果進行分析。結果表明，液料比(A)、提取溫度(B)、液料比二次項(A2)和提取時間二次項(D2)對響應值影響顯著。該回歸模型可信度較高，可以利用該模型分析及預測總黃酮提取率隨因素水平變化的波動情況。

2.1.2 交互作用的響應面分析

通過回歸方程(2)做響應曲面圖，見圖1。通過該組動態圖可對任何兩因素交互影響總黃酮提取率效果進行分析和評價，并從中確定4個因素的最佳范圍。

圖1 兩因素間交互作用對總黃酮提取率的響應面圖Fig.1 Response surface figures of interaction between two factors on extraction rates of total flavonoids

圖1中的6個圖分別反映了液料比和提取溫度、液料比和乙醇濃度、液料比和提取時間、提取溫度和乙醇濃度、提取溫度和提取時間、乙醇濃度和提取時間對美味牛肝菌總黃酮提取率的交互影響效應。由圖1可知，總黃酮提取率隨其中任意兩個變量的增加均呈現上升趨勢。

2.1.3 總黃酮提取工藝最佳參數的確定及驗證

對回歸方程求解，即美味牛肝菌總黃酮提取率達到最大值的工藝條件為：液料比30.34 (mL/g)、提取溫度84.16 ℃、乙醇濃度69.99%和提取時間119.46 min，在此條件下總黃酮的提取率為2.834%。為方便實際操作將試驗條件調整為：液料比30 (mL/g)、提取溫度85 ℃、乙醇濃度70%和提取時間120 min，通過試驗驗證得出美味牛肝菌總黃酮的平均提取率為2.82%，與理論值相差0.49%，與模型預測值相近，說明該回歸模型與實際試驗過程匹配程度高，可以有效地優化美味牛肝菌總黃酮的提取工藝。

3 結論

在單因素試驗結果的基礎上，通過響應面試驗優化得出美味牛肝菌總黃酮的最佳提取條件為：液料比30 (mL/g)、提取溫度85 ℃、乙醇濃度70%和提取時間120 min，在此條件下美味牛肝菌總黃酮的提取率為2.82%，驗證試驗也反映出采用響應面法優化總黃酮的提取工藝方法可靠。本研究方法綠色環保、得率高，能為開發出含活性物質總黃酮的美味牛肝菌天然調味料提供技術依據，發展前景廣闊。