基于LAMP技術檢測純芝麻醬中的多種植物源性成分

謝文佳，石盼盼，陳蕾 ，李軻

(1.河南省產品質量監督檢驗院，鄭州 450047；2.鄭州海關技術中心，鄭州 450003)

芝麻醬也叫麻醬，由炒熟的芝麻磨碎制成，味道鮮美，營養豐富，是一種深受消費者喜愛的香味調味品。但是，出于追求超額利潤的需要，部分不法商人可能在芝麻醬中摻入其他油料作物成分，不僅給消費者帶來了經濟損失，甚至危害消費者的身體健康[1]。目前，芝麻醬的摻假一般通過檢測芝麻醬中脂肪酸的種類和含量、特征風味物質[2，3]，或者利用分子生物學技術檢測目標物特異性DNA序列進行鑒定[4,5]。

環介導恒溫擴增技術(loop -mediated isothermal amplification，LAMP)是一種分子生物學技術檢測目標物特異性DNA序列的新方法。該方法利用4 條特異性引物識別靶基因上的6個特定區域和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下進行擴增反應，擴增效率可達108～1010 kb/min，反應擴增產物是一系列反向重復的靶序列構成的莖環結構和多環花椰菜結構的雙鏈DNA片段混合物。

本文根據芝麻、花生、葵花籽的特異性基因序列設計特異性引物，建立了芝麻醬中芝麻、花生、葵花籽源性成分的LAMP檢測方法，并應用該方法對市售的41份純芝麻醬樣品進行了檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：41種純芝麻醬樣品均隨機購自超市，芝麻、花生、葵花籽、大豆、水稻、玉米、燕麥、油菜、豌豆、高粱、赤小豆、小麥、蕓豆、大麥、黑豆等購自超市或農貿市場。

主要試劑：植物DNA提取試劑盒、大豆內源核酸檢測試劑盒、玉米內源核酸檢測試劑盒、水稻內源核酸檢測試劑盒、DNA擴增試劑盒(恒溫擴增法SR01-24，含酶)、植物內源核酸檢測試劑盒，均購自廣州迪澳生物科技有限公司；內引物、外引物和環引物由賽默飛世爾科技上海工廠合成。

1.2 主要儀器

LightCycler 480Ⅱ型熒光定量PCR儀：美國羅氏公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA提取

DNA提取采用植物基因組DNA提取試劑盒，按照使用說明書要求進行制備和提取，提取后均采用植物內源核酸檢測試劑盒進行LAMP擴增，出現典型的“S”型曲線說明提取的DNA符合要求。

1.3.2 引物設計

分別選擇芝麻2S Albumin、花生Arah2.01、葵花籽HaG5基因，使用Primer ExploerV4 (http：//primer exlorer.jp)設計相應的的特異性引物，分別包括2條外引物F3和B3、2條內引物FIP和BIP以及2條環引物FLP和BLP(花生無環引物)。引物DNA序列見表1，由賽默飛世爾科技上海工廠合成。

表1 LAMP擴增的引物Table 1 Primers for LAMP amplification

續 表

1.3.3 LAMP擴增反應

按照DNA擴增試劑盒(恒溫擴增法SR01-24，含酶)說明書內“實時熒光法”所示步驟使用熒光定量PCR儀進行LAMP反應，反應體系見表2。

表2 LAMP擴增的反應體系Table 2 The reaction system of LAMP amplification

反應條件為：63 ℃，30 s； 63 ℃，15 s；63 ℃，45 s；共60個循環。

1.3.4 引物特異性試驗

分別提取芝麻、花生、葵花籽、大豆、水稻、玉米、燕麥、油菜、豌豆、高粱、赤小豆、小麥、蕓豆、大麥、黑豆15種農作物樣本的DNA作為模板，用超純水代替DNA模板做陰性對照，以芝麻特異性引物進行LAMP擴增反應，驗證引物對芝麻源性成分檢測的特異性。同樣地，分別采用花生、葵花籽特異性引物進行LAMP擴增，驗證引物對花生、葵花籽源性成分檢測的特異性。

1.3.5 靈敏度試驗

以花生、葵花籽、大豆(質量比1∶1∶1)的充分混合物為基體，制成含芝麻質量百分比分別為5%、1%、0.5%、0.1%的混合物提取DNA，用超純水代替DNA模板做陰性對照，進行LAMP擴增，確定芝麻源性成分的檢測靈敏度。

以芝麻、葵花籽、大豆(質量比1∶1∶1)的充分混合物為基體，制成含花生質量百分比分別為5%、1%、0.5%、0.1%的混合物提取DNA，用超純水代替DNA模板做陰性對照，進行LAMP擴增，確定花生源性成分的檢測靈敏度。

以芝麻、花生、大豆(質量比1∶1∶1)的充分混合物為基體，制成含葵花籽質量百分比分別為5%、1%、0.5%、0.1%的混合物提取DNA，用超純水代替DNA模板做陰性對照，進行LAMP擴增，確定葵花籽源性成分的檢測靈敏度。

1.3.6 對市售41個芝麻醬樣品6種植物源性成分的檢測

從超市隨機購買41瓶芝麻醬，應用上述方法分別對這些樣本中的芝麻、花生、葵花籽源性成分進行檢測，并分別使用大豆內源核酸檢測試劑盒、玉米內源核酸檢測試劑盒、水稻內源核酸檢測試劑盒對大豆、玉米、水稻源性成分進行檢測，以調查市場上芝麻醬的真偽情況。

2 試驗結果

2.1 芝麻源性成分的檢測

2.1.1 引物的特異性檢測

根據芝麻2S Albumin基因所設計的內、外引物及環引物對芝麻DNA有顯著擴增，而對其他14種植物樣本DNA均無擴增，說明該引物對芝麻源性成分檢測具有良好的特異性，見圖1。

圖1 芝麻源性成分LAMP特異性擴增結果Fig.1 LAMP specific amplification results of sesame-derived components

注：0為陽性對照；1為芝麻；2～15為花生、葵花籽、大豆、水稻、玉米、燕麥、油菜、豌豆、高粱、赤小豆、小麥、蕓豆、大麥、黑豆；16為陰性對照。

2.1.2 芝麻源性靈敏度測定

從含芝麻質量百分比分別為5%、1%、0.5%、0.1%的混合物中提取DNA為模板進行LAMP擴增反應，都產生了明顯的熒光反應曲線，與之相對的陰性對照未檢測到擴增反應(見圖2)，因此該LAMP反應能夠檢測低至0.1%的混合物中芝麻源性成分的存在。

圖2 芝麻源性成分LAMP擴增靈敏度檢測結果Fig.2 Detection results of LAMP amplification sensitivity of sesame-derived components

注：0為陽性對照；1～4為5%、1%、0.5%、0.1%；5為陰性對照。

2.2 花生成分的檢測

2.2.1 引物的特異性檢測

根據花生Arah2.01基因所設計的內、外引物對花生DNA有顯著擴增，而對其他14種植物樣本DNA均無擴增，說明該引物對花生源性成分檢測具有良好的特異性，見圖3。

圖3 花生源性成分LAMP特異性擴增結果Fig.3 LAMP specific amplification results of peanut-derived components

注：0為陽性對照；1為花生；2～15為芝麻、葵花籽、大豆、水稻、玉米、燕麥、油菜、豌豆、高粱、赤小豆、小麥、蕓豆、大麥、黑豆；16為陰性對照。

2.2.2 花生源性靈敏度測定

從含花生質量百分比分別為5%、1%、0.5%、0.1%的混合物中提取DNA為模板進行LAMP擴增反應，都產生了明顯的熒光反應曲線，與之相對的陰性對照未檢測到擴增反應(見圖4)，因此該LAMP反應能夠檢測低至0.1%的混合物中花生源性成分的存在。

圖4 花生源性成分LAMP靈敏度檢測結果Fig.4 LAMP sensitivity test results of peanut- derived components

注：0為陽性對照；1～4為5%、1%、0.5%、0.1%；5為陰性對照。

2.3 葵花籽成分的檢測

2.3.1 引物的特異性檢測

根據葵花籽HaG5基因所設計的內、外引物及環引物對葵花籽DNA有顯著擴增，而對其他14種植物樣本DNA均無擴增，說明該引物對葵花籽源性成分檢測具有良好的特異性，見圖5。

圖5 葵花籽源性成分LAMP特異性擴增結果Fig.5 LAMP specific amplification results of sunflower seed-derived components

注： 0為陽性對照；1為葵花籽；2～15為花生、芝麻、大豆、水稻、玉米、燕麥、油菜、豌豆、高粱、赤小豆、小麥、蕓豆、大麥、黑豆；16為陰性對照。

2.3.2 葵花籽源性靈敏度測定

圖6 葵花籽源性成分LAMP靈敏度檢測結果Fig.6 LAMP sensitivity test results of sunflower seed-derived components

注：0為陽性對照；1～4為5%、1%、0.5%、0.1%；5為陰性對照。

從含葵花籽質量百分比分別為5%、1%、0.5%、0.1%的混合物中提取DNA為模板進行LAMP擴增反應，都產生了明顯的熒光反應曲線，與之相對的陰性對照中未檢測到擴增反應(見圖6)，因此該LAMP反應能夠檢測低至0.1%的混合物中葵花籽源性成分的存在。

2.4 市售41個芝麻醬樣品6種植物源性成分的檢測結果

市售41份芝麻醬樣本中全部檢出芝麻源性成分；檢出花生源性18例，占比為43.90%；檢出葵花籽源性成分1例，占比為2.43%；檢出大豆源性成分2例，占比為4.89%；水稻源性和玉米源性成分均未檢出。

3 討論

環介導恒溫擴增技術 (loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是2000年由日本研究人員Notomi等發明的一種較為新型的體外DNA擴增技術，該方法克服了熒光定量PCR技術需要通過反復的熱變性過程獲得單鏈模板的缺點，大大節省了反復升降溫的時間，可實現在恒溫條件下進行連續的快速擴增，不需要復雜、昂貴的溫控和輔助設備；同時，該方法不需合成價格昂貴的探針，但仍然具有高度的反應特異性。因此，LAMP技術是一種更為準確、簡便，能夠適應大批量樣本的現場快速鑒定的技術，已在臨床病原微生物檢測、遺傳病診斷、SNP分型、傳染病監測和轉基因食品鑒定等領域顯示出了巨大的應用潛力并正得到日益廣泛的應用。

本文建立了一套利用LAMP技術進行芝麻醬中芝麻、花生、葵花籽源性成分的檢測方法，能夠在60 min內檢測低至0.1%的混合物中芝麻、花生、葵花籽源性成分的存在，具有良好的特異性，對芝麻醬摻假的鑒別有重要的實用價值。從本次市場抽取41個純芝麻醬的檢測結果發現，市售芝麻醬產品摻入花生、葵花籽、大豆等成分冒充純芝麻醬的現象比較普遍。