紅糖HPLC-DAD指紋圖譜與化學模式識別

陳其釗，陳紅香*，陳嘉敏，王桂華，李家威，余構彬

(1.廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業研究所)，廣東省甘蔗改良與生物煉制 重點實驗室，廣州 510316；2.國家糖業質量監督檢驗中心，廣州 510316)

紅糖是以甘蔗為原料經壓榨、“連環鍋”熬煮、石灰澄清、過濾除雜、蒸發濃縮、攪拌起晶后形成的非分蜜糖。因沒有經過高度精練，紅糖營養成分比白砂糖高很多，由于其除糖外還含有維生素和微量元素，如鐵、鋅、錳、鉻等[1,2]。《本草綱目》中記載：沙糖性溫，和脾緩肝。中醫認為，紅糖性溫、味甘、入脾，具有益氣補血、健脾暖胃、緩中止痛、活血化瘀的作用，尤其適合年老體弱、大病初愈、月經不調的人群以及產婦食用[3,4]。日本美容醫生認為，含有紅糖成分的面膜的美容效果比流行的激光祛斑、果酸換膚等更好[5]，因其蘊含的胡蘿卜素、核黃素、煙酸、氨基酸、葡萄糖等成分對細胞有強效抗氧化及修護的作用，能預防黑色素生成，持續美白等。紅糖中的一些酚類物質和抗氧化物質還可以清除自由基，維護細胞的正常功能和新陳代謝[6]。此外，其中還含有某些可以有效調節體內各種色素代謝過程的天然酸類和色素調節物質。

現代指紋圖譜技術應用于鑒定、溯源、質量控制工作，主要原理是將研究對象的指紋圖譜和對照指紋圖譜進行相似性評價，即比較兩者間的差異性和共性，從而實現質量控制等目的[7]。通過指紋圖譜的特征性，能更有效甄別樣品；通過對指紋圖譜的共有峰進行對比監控，能有效控制樣品的質量，確保樣品質量的相對穩定。指紋圖譜應用于中藥鑒定領域的技術體系已比較成熟，現也逐漸應用于食品鑒別領域中，目前應用比較多的是茶葉、食用菌、調味料以及肉類這幾類食品的品質鑒定上[8-16]，準確度、可靠度、可行性都比較高。

本試驗采用高效液相色譜法，建立了21批紅糖樣品的指紋圖譜，并結合聚類分析和主成分分析為紅糖產品進行綜合評價提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二銨、磷酸：分析純；甲醇、乙腈：色譜純，默克公司；pH計：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；旋轉蒸發儀：德國IKA公司；e2695高效液相色譜儀：美國沃特世公司。

21批次紅糖樣品均來自2017-2019年廣東、廣西、云南3個不同產地的企業的送檢(見表1)。

表1 紅糖樣品來源Table 1 The source of brown sugar samples

續 表

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：MYCOTOXTM反相C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相：A 0.1 mol/L磷酸二氫鈉(pH 2.3)∶B乙腈為98∶2，等度洗脫。檢測波長：210 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.5 mL/min；進樣量：20 μL。

1.2.2 供試品溶液的制備

稱取10 g樣品，以無水乙醇100 mL作為提取溶液，攪拌，至完全溶解(約30 min)，用濾紙過濾，去掉不溶物，將濾液置于雞心瓶中于40 ℃旋干，得到固體。將得到的干燥固體以超純水做溶劑，配制成10 mg/mL的待測溶液，以0.22 μm微孔濾膜過濾，得到供試液溶液。

1.3 HPLC指紋圖譜的方法學考察

1.3.1 精密度試驗

取同一批次紅糖樣品溶液(編號：S1)，連續進樣6次，選取9號色譜峰為參照峰。計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD值。

1.3.2 重復性試驗

取同一批次紅糖樣品溶液(編號：S1)共6份，按1.2.1項下色譜條件分別測定，記錄保留時間和峰面積。

1.3.3 穩定性試驗

取同一批次紅糖樣品溶液(編號：S1)，分別在0,2,4,6,8,12,24 h，按1.2.1項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。

2 結果與分析

2.1 紅糖指紋圖譜的測定

指紋圖譜方法學考察表明無論精密度試驗、重復性試驗還是穩定性試驗，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%，表明精密度、重復性、穩定性良好，符合指紋圖譜研究的技術要求。

分別取不同廠家的21批紅糖樣品，按1.2.2項下方法制備供試品溶液，分別進樣測定，記錄各批次供試品溶液的全波長指紋圖譜并對21批次紅糖樣品的紫外色譜指紋圖譜相關參數進行比較，對樣品中峰面積較穩定且各樣品中共有的色譜峰進行標定。

2.2 指紋圖譜共有模式的建立

將得到的色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2012年版)，對選定的HPLC圖譜進行多點校正，自動匹配，建立不同產地紅糖HPLC指紋圖譜，并計算相似度值，結果見圖1、圖2和表1。其中出峰時間基本一致、峰面積相對較大的13個色譜峰被設為特征共有峰，9號峰的分離度較好并且峰形對稱，所以選擇其為參照峰。21批樣品共有峰相對保留時間、相對峰面積范圍見表2。

圖1 21批紅糖樣品HPLC-PDA色譜指紋圖譜Fig.1 HPLC-PDA fingerprint spectra of 21 batches of brown sugar samples

圖2 紅糖的HPLC-PDA對照指紋圖譜Fig.2 HPLC-PDA control fingerprint spectra of brown sugar

表2 21批樣品共有峰的相對峰面積Table 2 Relative peak area of common peaks of 21 batches of samples

2.3 指紋圖譜的相似度評價

由表1可知，不同產地紅糖的指紋圖譜相似度在0.480～0.985之間，說明不同產地的紅糖所含的化學成分和質量有一定的區別。紅糖的質量分級是以總糖分作為指標，從相似度看，不同等級紅糖間的圖譜整體面貌基本一致，個別樣品比較突出，說明產品質量受產地、氣候、生態環境及廠家生產工藝的影響。

2.4 聚類分析

將21批不同產地的紅糖樣品13個共有峰相對峰面積導入SPSS 19.0軟件進行系統聚類，采用組間聯接法，以歐氏距離(Euclidean Distance)作為樣品分類依據對其進行系統聚類分析，得到聚類樹狀圖，見圖3。

圖3 聚類分析樹狀圖Fig.3 Dendrogram of cluster analysis

由圖3可知，當類間距離大于20時，21批紅糖樣品聚為A，B兩大類，其中A類分為A1類和A2類，S8、S9、S10、S12、S13、S14、S18聚為A1類，S1、S4、S5、S6、S7、S11、S15、S16、S17、S19、S21聚為A2類，S2、S3、S20聚為B類。

2.5 主成分分析

本試驗將21批樣品的13個共有峰峰面積導入SPSS 19.0軟件，計算相關系數矩陣、特征值和方差貢獻率，進行主成分分析，并將特征值大于1的成分提取出來，得到數個主成分，結果見表3和表4。

表3 特征值與貢獻率Table 3 Eigenvalues and contribution rates

表4 旋轉后公共因子載荷矩陣Table 4 Public factor loading matrix after rotation

由表3可知，前3個主成分特征值大于1，對方差的累積貢獻率為85.593%，因此可見紅糖的多個成分可以簡化為3個主成分進行分析。載荷的絕對值越大，對主成分的貢獻越大。由表4可知，峰4和峰10在主成分1上有較高的載荷，峰1和峰2在主成分2上有較高的載荷，峰6在主成分3上有較高的載荷(載荷絕對值大于0.8)。

2.6 綜合質量評分

由表5可知，S21樣品主成分因子綜合得分最高，該批樣品中成分 3,4,5,7,9,10,12,13的含量相對較高，整體質量相對較好。

2.7 OPLS-DA

偏最小二乘法是一種化學計量學統計方法，廣泛應用于代謝組學中，其所建立的數學模型能對“多靶點、多成分和整體作用”的研究對象的化學成分和生物活性物質之間的聯系進行有效分析[18，19]。

將3個產地的紅糖指紋圖譜中標定的13個共有峰的峰面積導入SIMCA-P 14.0軟件中進行分析，建立的模型的R2為0.74，Q2為0.481，為了進一步分析，將3個產地進行兩兩對比，作OPLS-DA分析得到的得分圖，見圖4～圖6。

圖4 廣東-廣西紅糖OPLS-DA分析得力圖Fig.4 OPLS-DA score plot of brown sugar in Guangdong-Guangxi Province

圖5 廣東-云南紅糖OPLS-DA分析得力圖Fig.5 OPLS-DA score plot of brown sugar in Guangdong-Yunnan Province

圖6 廣西-云南紅糖OPLS-DA分析得力圖Fig.6 OPLS-DA score plot of brown sugar in Guangxi-Yunnan Province

由圖4～圖6可知，不同產地的成分構成模式大致可以區分開。

根據主成分分析結果，選出了兩個主成分，依據離原點越遠的點對分組貢獻越大的原則，結合由OPLS-DA分析得到的變量投影重要性指標(VIP)值，見表6。

表6 3個產地的紅糖OPLS-DA分析的VIP值表Table 6 VIP values of OPLS-DA analysis of brown sugar in three producing areas

找出3個產地紅糖差異性組分。由表6可知，與產地廣東相比，產自廣西的紅糖在保留時間為5.825，6.43，7.51，16.54，29.30 min的成分有差異，產自云南的紅糖的保留時間為7.512,10.40 min的成分有差異，產地廣西與產地云南相比，差異成分為保留時間6.43,9.22,16.54 min的成分。這些差異成分是區分3個不同產區紅糖質量的主要指標性物質(但由于缺少標準品的對照，暫時無法對相關物質進行確認)。

3 討論

采用二極管陣列檢測器在190～400 nm波長范圍內進行紫外全波長掃描，結果發現在210 nm波長以下有最大吸收，由于接近末端吸收，所以選擇210 nm波長作為檢測波長，在此波長下色譜圖基線噪音較低，各峰的保留時間適中，分離度較好，基線穩定，有利于指紋圖譜分析。紅糖中的糖分很高，而且沒有紫外吸收，濃縮時會使供試液很粘稠而影響測定，因此利用蔗糖、葡萄糖、果糖這類物質在乙醇中的溶解度低，而非糖組分如有機酸類、氨基酸類、酚類等物質能溶于乙醇的特點，選擇無水乙醇作為提取溶劑。此外，通過對磷酸氫二銨-乙腈、磷酸-乙腈、磷酸二氫鈉-乙腈3個流動相系統(等度洗脫)進行考察，結果只有磷酸二氫鈉-乙腈系統各峰分離度比較好；進一步優化后發現，以乙腈-0.1 mol/L磷酸二氫鈉水溶液洗脫效果最好，出峰數最多，基線平穩，各峰分離度均達到分離要求。

本次試驗通過多點校正得到了21批紅糖指紋圖譜以及對照圖譜，通過數據對比可知21批紅糖基本相似，含量有差別，該指紋圖譜對紅糖產品的溯源、質量控制及功效成分的研究具有參考價值。

將3個產地的紅糖非糖組分的13個共有峰的數據導入SIMCA-P軟件進行主成分分析，分析3個產地的共有物質的含量模式相似情況，尋找主要差異成分。經PLS-DA驗證模型有效后，通過OPLS-DA分析得到變量投影重要性指標(VIP)值可知，3個產地之間的差異組分主要是保留時間為5.82,6.43,7.51,16.54,29.30,9.22,10.40 min對應的物質。這些差異組分均未知，需要結合質譜等手段進一步確定。

由指紋圖譜對比分析和主成分分析結果可知，不同產地紅糖組分的構成和含量均存在差異，這種差異可能是由不同產地甘蔗的生長環境氣候、土壤以及生產工藝造成的。因此，可以通過建立指紋圖譜的方法，對未知樣品進行指紋圖譜比對，從而實現溯源的目的。