海茸中L-巖藻糖及硫酸基的測定

顏麗，劉秀河*，趙方銘，李同樂

(1.齊魯工業大學(山東省科學院),濟南 250353；2.濟南褐藻生物工程有限公司，濟南 250353)

海茸是海藻中一種淡黑巨海藻，是野生天然的深海植物，又因其生長環境特殊，采摘期短，因此非常珍貴稀有[1]。國內外對海茸保健功能的研究逐步深入，在我國海茸有著悠久的食用傳統，在許多古代醫學典籍中都有提及[2]。在食品行業，李建杰等[3]以木糖醇、甘露醇、山梨醇3種糖醇復配作為填充劑，以抹茶粉和食鹽作為風味調節劑，成功研制了一款具有海洋特色的抹茶海鹽口味南極海茸多糖咀嚼片。多糖是食品中的一類重要物質，可獨立成膠替代傳統增稠乳化穩定劑，常用于海產品中改良產品體系的質構和功能特性[4]。隨著多糖成為研究熱點，海洋多糖備受重視，多糖提取的方法有水提醇沉法、堿水提取法、酶解法等[5]，海茸中L-巖藻糖含量對于巖藻多糖在食品與調味品領域的應用具有重要的指導意義。

本文主要對海茸中L-巖藻糖含量及硫酸基含量、褐藻膠含量等進行了測定，為后期實驗的進行奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 主要儀器

TG16-WS高速臺式離心機 湖南湘儀開發有限公司；數顯恒溫水浴鍋 金壇市金南儀器廠；紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.1.2 主要試劑

海茸：智利海域；L-巖藻糖標準溶液(20 mg)：北京中科質檢生物技術有限公司；硫酸鉀：天津市大茂化學試劑廠；三氯乙酸、蒽酮：國藥集團化學試劑有限公司；明膠：天津市富宇精細化工有限公司；氯化鋇：天津市廣成化學試劑有限公司。

1.2 溶液的配制

1 mg/mL L-巖藻糖標準樣品:在購買的L-巖藻糖標準溶液中加入20 mL水。

0.12 mg/mL L-巖藻糖標準樣品：吸取1200 μL 1 mg/mL L-巖藻糖標準樣品，定容至10 mL。

0.1%蒽酮-硫酸溶液：稱取0.1 g蒽酮，溶于100 mL濃硫酸中，于棕色瓶中保存，該溶液最多于冰箱中放置48 h。

0.5%明膠：精確稱取1.25 g明膠于蒸餾水中，于60～70 ℃水浴中溶解完全，定容至250 mL容量瓶中。4 ℃下靜置過夜，冷藏陳化。

明膠-氯化鋇溶液：精確稱取1.0 g氯化鋇溶液于100 mL明膠溶液中，定容，于4 ℃靜置2 h，冷藏保存。

硫酸鉀標準溶液：精確稱取105 ℃干燥至恒重的K2SO4固體 108.75 mg，用1 mol/L的鹽酸定容至100 mL，即得0.6 mg/mL的硫酸鉀標準溶液[6]。

1.3 海茸中L-巖藻糖含量的測定

1.3.1 L-巖藻糖標準溶液的制備

分別吸取0.12 mg/mL L-巖藻糖標準樣品0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，置于10 mL具塞試管中，用蒸餾水定容至2.0 mL，之后迅速加入0.1%的蒽酮-硫酸溶液6 mL，搖勻后靜置15 min，之后立即放入冰水浴中15 min，取出后在580 nm處測定吸光度，以濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.2 樣品溶液中L-巖藻糖的測定

將海茸粉碎后過80目篩，用天平稱取1.002 g粉末(精確到0.001 g)，加入50 mL蒸餾水，靜置1 h，加熱回流4 h，靜置冷卻至室溫，置于離心機中以9000 r/min 離心30 min，然后將上清液移入100 mL容量瓶中，沉淀用少量水分次洗滌，以9000 r/min離心后將上清液轉入同一容量瓶中[7]。

量取上清液2 mL，置于50 mL離心管中，邊攪拌邊加入30 mL無水乙醇，搖勻，于4 ℃放置12 h，取出后以9000 r/min 離心30 min，棄去上清液，沉淀用沸水溶解，放冷，轉移至100 mL容量瓶中定容。

吸取2 mL上清液，置于10 mL具塞試管中，迅速精密加入0.1%的蒽酮-硫酸溶液6 mL，搖勻靜置15 min，之后立即放入冰水浴中15 min，測定樣品吸光值。海茸中L-巖藻糖含量計算公式如下[8]：

L-巖藻糖含量=C×D×f/m×100%。

式中：C為L-巖藻糖的濃度，mg/mL；D為樣品稀釋倍數；f為換算因子；m為樣品重量，mg。

1.3.3 換算因子測定

精密吸取L-巖藻糖標準液0.5 mL，按標準曲線的操作方法，測吸光度值，由回歸方程求供試液中L-巖藻糖的含量，計算換算因子[9]：

f=w/cd。

式中：f為換算因子；w為所取L-巖藻糖濃度，mg/mL；c為L-巖藻糖測定濃度，mg/mL；d為稀釋因子。

1.3.4 回收率實驗

為了檢驗本方法的準確性和可靠性，要進行回收率實驗，測定方法如下：

因標品配制濃度過高，經預實驗后將L-巖藻糖標品濃度稀釋20倍，配制成0.006 mg/mL的溶液，取L-巖藻糖標準溶液2 mL與L-巖藻糖樣品液2 mL組成加樣樣品液，然后吸取此加樣樣品液2 mL，按標準曲線的制作方法，在580 nm處測定吸光度。

回收率=(加標L-巖藻糖含量-樣品L-巖藻糖含量)/標品含量×100%。

1.3.5 重復性測定

精密量取6份海茸各1 g，按供試品溶液的配制方法制備成6份供試品溶液，各精密吸取2 mL，按上述方法測定L-巖藻糖的含量，檢驗該方法的重復性。

1.3.6 精密度實驗

精密吸取同一個均勻供試品溶液6份各2 mL，按上述方法測定L-巖藻糖的含量，檢驗該方法的精密度。

1.4 L-巖藻糖中硫酸基的測定

1.4.1 K2SO4標準溶液配制

吸取標準 K2SO4溶液 0.00，0.04，0.08，0.12，0.16，0.20 mL，用1 mol/L鹽酸溶液定容至0.20 mL，加入3%三氯乙酸3.8 mL 及氯化鋇明膠溶液1.0 mL，搖勻，室溫靜置 15 min，于360 nm 波長處測定吸收度 A1；以1.0 mL明膠溶液代替氯化鋇明膠溶液，測吸收度A2。以硫酸基濃度(mg/mL) 為橫坐標，吸光度(A1-A2)為縱坐標繪制標準曲線。

1.4.2 L-巖藻糖樣品溶液中硫酸基測定

取1.3.2所述的醇沉后的巖藻糖溶液，于烘箱中烘干，得約50 mg干制巖藻糖粉末，然后加入25 mL 1 mol/L鹽酸溶液，于100 ℃下加熱6 h，冷卻后以8000 r/min離心20 min，過濾，用HCl定容至25 mL。吸取0.2 mL，加入3% TCA 3.8 mL 及BaCl2-明膠溶液1.0 mL，搖勻，室溫靜置 15 min，于360 nm 波長處測定吸收度 A1；以1.0 mL明膠溶液代替氯化鋇明膠溶液，測吸收度A2，公式如下[10]：

SO42-含量=f×(C/0.2)×V/W×100%。

式中：f為換算因子；C為SO42-測定濃度，mg/mL；V為樣品水解液總體積；W為初始樣品質量。

1.4.3 換算因子的測定

精密吸取K2SO42-標準貯備液0.15 mL，按標準曲線的操作方法，測吸光度值，由回歸方程求供試液中SO42-的含量，根據 f=w/cd 計算換算因子，其中 w 為所取硫酸根濃度，c為硫酸根測定濃度，d為稀釋因子。

1.4.4 回收率實驗

因標品配制濃度過高，經預實驗后將SO42-標品濃度稀釋10倍，配制成0.06 mg/mL的溶液，分別取0.2 mL標準溶液與0.2 mL樣品溶液組成加樣樣品液，然后吸取此加樣樣品液0.2 mL，按標準曲線的制作方法，在360 nm處測定吸光度。

1.4.5 精密度的測定

精密吸取同一個均勻供試品溶液6份各0.2 mL，按上述方法測定SO42-的含量，檢驗該方法的精密度。

1.4.6 重復性的測定

精密量取 6 份干燥的L-巖藻糖樣品各50 mg，按供試品溶液的配制方法制備成 6 份供試品溶液，各精密吸取0.2 mL，測定硫酸基含量。

1.5 褐藻膠含量的測定(質量法)[11]

將海茸粉碎過40目篩網，稱取過篩后的海茸2 g于燒杯中，向其中加入0.5 g固體碳酸鈉和50 mL水,在80～90 ℃下水浴加熱2 h，期間不斷攪拌，當燒杯內全部物質呈糊狀時停止，加水稀釋至100 mL，攪拌均勻，以4000 r/min離心10 min，收集上清液，向濾渣中加入少量的水，加溫攪拌，離心，收集上清，合并2次上層液，其中加入1∶1的鹽酸，調制pH為2.0，靜置老化30 min后，經過100目篩網過濾，使大部分酸液流出，不斷攪拌酸液并向其中不斷加入2 mol/L氫氧化鈉溶液至pH 6.0～7.0；加入海藻酸鈉溶液1倍體積的95%乙醇，沉淀脫水，用尼絨篩絹過濾擰干，放入烘箱中，于103 ℃烘干至恒重，記錄質量。測定結果按下式計算：

褐藻膠含量=m1/m2×100%。

式中：m1為烘干后褐藻膠的質量，g；m2為樣品質量，g。

2 結果與分析

2.1 海茸中L-巖藻糖含量

2.1.1 L-巖藻糖標準曲線繪制

表1 L-巖藻糖標準曲線測定結果Table 1 Determination results of L-fucose standard curve

根據表1繪制的L-巖藻糖標準曲線見圖1。

圖1 L-巖藻糖標準曲線Fig.1 Standard curve of L-fucose

由圖1可知，當L-巖藻糖濃度在0～18 μg/mL范圍內線性關系良好，所得的回歸方程為y=21.167x+0.0304，R2=0.9982。

2.1.2 換算因子測定結果

根據公式f=w/cd計算，w為所取巖藻糖的濃度，為0.12 mg/mL，c為巖藻糖測定濃度，測定吸光值為0.195，根據標準曲線所得，L-巖藻糖濃度為0.0077 mg/mL，因此得出換算因子f=0.965。

2.1.3 樣品中L-巖藻糖含量

根據海茸中L-巖藻糖含量的測定公式：L-巖藻糖含量=C×D×f/m×100%，得出結果見表2。

表2 樣品中L-巖藻糖的含量測定Table 2 Determination of L-fucose content in samples

2.1.4 回收率實驗結果

回收率實驗結果見表3。

表3 樣品回收率實驗結果Table 3 Experimental results of recovery rates of samples

由公式回收率=(加標樣品含量-樣品含量)/標品含量×100%，可計算出回收率為94.46%，且RSD=2.22%<5%,證明該結果準確性良好。

2.1.5 精密度實驗測定結果

取同一份樣品測量6次，實驗結果見表4。

表4 海茸中L-巖藻糖含量Table 4 The content of L-fucose in seaweed

經實驗結果證明，RSD為1.46%<5%，證明該實驗精密度良好。

2.1.6 重復性實驗結果

按照2.1.5所述的6個海茸樣品測得的L-巖藻糖含量見表5。

表5 L-巖藻糖含量測定結果Table 5 Determination results of L-fucose content

由表5可知，6組海茸樣品的含量差不多，得出的RSD為1.06%<5%，因此該實驗的重復性良好。

2.2 L-巖藻糖中SO42-含量測定

2.2.1 硫酸根標準曲線繪制

表6 SO42-標準曲線測定結果Table 6 Determination results of SO42- standard curve

根據表6繪制的SO42-標準曲線見圖2。

圖2 SO42-標準曲線Fig.2 Standard curve of SO42-

由圖2可知，SO42-濃度在0～24 μg/mL時呈現良好的線性關系，此時標準曲線回歸方程為y=15.277x-0.0025，R2=0.9958。

2.2.2 換算因子測定

根據公式f=w/cd，w為所取SO42-的含量，為0.09 mg，c為SO42-測定含量，測定吸光值為0.293，根據標準曲線所得，SO42-濃度為0.0193 mg/mL，測得的SO42-含量為0.002895 mg，因此得出換算因子f=1.241。

2.2.3 L-巖藻糖中SO42-含量

SO42-含量測定結果見表7。

表7 SO42-的測定結果Table 7 Determination results of SO42-

由公式得SO42-含量=(C/0.2)×V×f/W=3.746%，且RSD為0.72%，說明該數據準確性良好。

2.2.4 回收率實驗結果

SO42-的回收率結果見表8。

表8 SO42-回收率測定結果Table 8 Determination results of SO42- recovery rates

由公式回收率=(加標樣品含量-樣品含量)/標品含量×100%，可計算出回收率為95.28%，且RSD=2.67%<5%,證明該結果準確性良好。

2.2.5 精密度實驗測定結果

取同一份樣品測量6次，實驗結果見表9。

表9 L-巖藻糖中SO42-含量Table 9 The content of SO42- in L-fucose

經實驗結果證明，相對標準偏差RSD為1.41%<5%，證明該實驗重復性良好。

2.2.6 重復性實驗結果

按照2.2.5所述的稱取的6組巖藻糖樣品測得的SO42-含量的結果見表10。

表10 SO42-含量重復性測定結果Table 10 Repeatability testing results of SO42- content

2.3 褐藻膠含量測定

海茸的褐藻膠含量測定結果見表11。

表11 褐藻膠含量測定結果Table 11 Determination results of sodium alginate content

根據公式褐藻膠含量=m1/m2×100%=74.5%，RSD值為2.01%<5%，證明該結果準確性良好。

3 結論

繪制了L-巖藻糖的標準曲線，L-巖藻糖在0～18 μg/mL呈良好的線性關系，R2=0.9982；采用熱水浸提法提取海茸中L-巖藻糖，其含量為5.790%，回收率為94.46%，相對標準偏差為1.46%和1.06%，表明精密度和重復性良好，用比色法測定 L-巖藻糖簡單、準確、快速、方便，適合在實驗室中操作。用硫酸鋇比濁法測定多糖中硫酸基含量，設備要求較低，操作簡便，適用于普通實驗室[12]；硫酸根濃度的吸光值在0～24 μg/mL范圍內線性關系良好，R2=0.9958；測定海茸中L-巖藻糖的SO42-為3.746%，回收率為95.28%，相對標準偏差為1.41%和3.22%，精密度和重復性良好。海茸中褐藻膠含量達到74.5%。