響應面法優化貝萊斯芽孢桿菌發酵水豆豉的工藝條件

李楊，陳宇航,，劉雪薇，裴曉方*

(1.四川大學 華西公共衛生學院/華西第四醫院，成都 610041； 2.食品安全監測與風險評估四川省重點實驗室，成都 610041； 3.上海市疾病預防控制中心，上海 200336)

水豆豉作為傳統黃豆發酵食品，深受西南地區人民喜愛。微生物在發酵過程中產生酶而使黃豆中的原料發生水解，形成了水豆豉特有的風味。水豆豉富含蛋白質、維生素、礦物質等營養物質，并有潛在的預防胃損傷和抗氧化等功能[1]。發酵過程中有大量諸如豆豉纖溶酶、抗氧化劑等代謝產物產生[2]，豐富食品的營養價值。但是，我國水豆豉的生產仍以自然發酵為主。在自然發酵過程中，不同生產來源的水豆豉容易受發酵溫度、時間、微生物這些環境因素的影響，無法保障水豆豉的營養價值及食用安全。本課題組前期從水豆豉中分離得到一株高產豆豉纖溶酶的貝萊斯芽孢桿菌，若能將其接種黃豆進行發酵條件的優化，將會大大提高水豆豉的發酵品質。

水豆豉的發酵步驟可分為：浸泡、瀝水、蒸煮、冷卻、前發酵、加輔料及后發酵階段。由于后發酵階段涉及佐料的加入以及發酵時間過長，本研究主要優化前發酵階段的環境參數。發酵過程中影響水豆豉品質的環境參數有很多，最常納入優化的發酵條件有發酵溫度、發酵時間和菌株接種量[3-5]。本研究首先通過單因素法控制發酵溫度、發酵時間和菌株接種量，縮小發酵條件范圍，再根據響應面法優化得出水豆豉的最優發酵條件，比較發酵優化水豆豉與市售水豆豉之間的差異，為貝萊斯芽孢桿菌發酵水豆豉提供了科學理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

一等黃豆：成都人民營養食品廠；貝萊斯芽孢桿菌：本課題組分離純化；LB肉湯：北京路橋技術有限責任公司；市售水豆豉：貴州某品牌；纖維蛋白原F3879-250 mg、凝血酶T4648-1 kU：Sigma公司；尿激酶 U108373-10 mg：Aladdin公司；瓊脂糖：TQINGKE公司；鹽酸：北京化工廠；無水碳酸鈉：天津博迪化工股份有限公司；磷酸氫二鈉、四硼酸鈉：天津市瑞金特化學品有限公司；酚酞、乙醇、甲醛：成都市科龍化工試劑廠；氫氧化鈉：天津致遠化學試劑有限公司。

1.2 設備與儀器

PICO21、FRESCO21離心機 Thermo公司；SQP千分之一、萬分之一電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；隔水式恒溫培養箱 上海飛越實驗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 水豆豉發酵步驟

稱取30 g黃豆，加入3倍浸泡水量的超純水，浸泡12 h。瀝干后高壓蒸汽滅菌30 min，待自然冷卻接入菌液搖勻，恒溫培養，1～5 d后收獲水豆豉。同時設置陰性對照，即黃豆經高壓滅菌后不接種菌液，其余發酵步驟相同。

1.3.2 水豆豉發酵檢測指標

針對水豆豉發酵優化方向，檢測指標包括感官指標和理化指標。

1.3.2.1 感官指標[6]

感官指標分為形態、粘液、拉絲、氣味、口感5個部分，由實驗人員組成評價小組，獨立判斷后打分，取平均值作為最終結果。

表1 水豆豉感官評分表Table 1 Sensory evaluation standard of fermented soya beans

注：拉絲長度測定標準是將水豆豉攪拌2 min后，用槍頭挑起，以10 cm為1個單位從中間挑起，垂直拉10 cm為2個單位，再從拉起的10 cm中挑起，重復進行，直到拉絲斷裂，記錄拉絲單位。

1.3.2.2 理化指標

理化指標包括氨基酸態氮、總酸、還原糖、pH值和豆豉纖溶酶活性，參照國標GB 5009.235-2016《食品中氨基酸態氮的測定》、GB 5009.7-2016《食品中還原糖的測定》、GB 5009.237-2016《食品中pH值的測定》的方法[7-9]，采用化學法測定水豆豉中的氨基酸態氮、總酸和還原糖含量，采用pH計檢測水豆豉中的pH值，采用纖維蛋白平板法檢測水豆豉中的豆豉纖溶酶活性[10]。

1.3.3 單因素法發酵試驗

選取不同發酵時間(1，2，3，4，5 d)、不同發酵溫度(25，30，35，40，45 ℃)和不同接菌量(0.01%、0.1%、1%、5%、10%)3個因素做單因素法發酵試驗，以水豆豉發酵檢測指標作為評價標準來縮小最佳發酵條件范圍。

1.3.4 響應面法發酵試驗

在單因素發酵試驗的基礎上，經Design Expert 8.0.6軟件，以水豆豉中氨基酸態氮含量(Y1)和豆豉纖溶酶活性(Y2)為響應指標，以Box-Behnken模型按照三因素三水平設計獲得17種發酵條件，包括13個析因實驗和4個檢驗誤差的零點試驗。按1.3.1發酵步驟進行試驗，確定最優發酵條件。

1.3.5 最優發酵條件水豆豉品質檢測

參照1.3.2.2的方法，將最優發酵條件的水豆豉與市售的水豆豉進行比較，以未加菌發酵的黃豆作為陰性對照，檢測理化指標包括氨基酸態氮、總酸、pH值、還原糖含量和豆豉纖溶酶活性。

2 結果與分析

2.1 單因素法發酵試驗

2.1.1 發酵時間對水豆豉發酵檢測指標的影響

不同發酵時間下，水豆豉發酵檢測指標變化見圖1。

由圖1可知，氨基酸態氮含量隨著發酵時間的增加而增加。總酸含量在0～2 d增加，在3～5 d下降。還原糖含量在0～3 d基本保持穩定，3～4 d上升，4～5 d下降。pH值在發酵5 d內變化較小，酸堿度從弱酸性變為中性。豆豉纖溶酶活性在0～4 d內都呈現上升趨勢，在3 d達到最大，之后隨著時間延長，酶活性略有下降。感官評價差異較小，在41～63分范圍內。因為氨基酸態氮含量、還原糖含量、豆豉纖溶酶活性為越高越好，總酸含量為越低越好，綜合考慮，將發酵時間限定在3～5 d。

圖1 不同發酵時間對水豆豉發酵檢測指標的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the detection indicators of fermented soya beans

2.1.2 發酵溫度對水豆豉發酵檢測指標的影響

不同發酵溫度下，水豆豉發酵檢測指標變化見圖2。

由圖2可知，氨基酸態氮含量在25～40 ℃范圍內逐漸上升，在40～45 ℃范圍內開始下降。總酸含量波動較大，25～35 ℃范圍內總酸含量高于30～45 ℃。還原糖含量也呈現波動狀態，先增加后降低再上升。pH值在發酵5 d內變化較小。豆豉纖溶酶在25～40 ℃范圍內，活性先降低后升高，45 ℃時未檢測到酶活性。感官評價指標變化較小，在40～65分范圍內。綜合考慮，將發酵溫度范圍限定在35～40 ℃。

圖2 不同發酵溫度對水豆豉發酵檢測指標的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the detection indicators of fermented soya beans

2.1.3 接菌量變化對水豆豉發酵檢測指標的影響

不同接菌量下，水豆豉發酵檢測指標變化見圖3。

圖3 不同接菌量對水豆豉發酵檢測指標的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on the detection indicators of fermented soya beans

由圖3可知，接菌量對氨基酸態氮含量、總酸含量、還原糖含量及pH值的影響均較小。豆豉纖溶酶活性變化較大，0.01%～1%范圍內活性下降明顯，1%～10%范圍內保持穩定。感官評價指標的變化依舊不明顯，在42～45分范圍內。考慮不同接菌量下氨基酸態氮、還原糖、總酸、pH值變化較小，以豆豉纖溶酶活性變化為主，將接菌量限定在0.01%～0.1%范圍內。

2.2 響應面法發酵試驗

單因素發酵試驗縮小的最佳發酵條件范圍為發酵時間3～5 d，發酵溫度35～40 ℃，接菌量0.01%～0.1%。根據該條件設計的試驗因素水平見表2，試驗設計和檢測結果見表3。

表2 試驗因素編碼及水平表Table 2 The factors and levels of experiment

表3 響應面試驗設計及指標Table 3 Response surface design and responses

2.2.1 回歸模型建立及方差分析

應用Design Expert 8.0.6軟件對表3中的數據進行回歸分析，得到回歸方程預測模型：

Y1=5.83×10-5-2.47×10-5×A+1.94×10-3×B-5.91×10-6×C。

Y2=2594.70-55.88A-415.30B+7970.77C-10.73AB-182.17AC-1467.06BC+0.96A2+107.93B2+36394.11C2。

方差分析驗證模型及各參數的顯著性見表4和表5。

表4 氨基酸態氮回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression model of amino acid nitrogen

注：“*”表示P<0.05；“**”表示P<0.01。

表5 豆豉纖溶酶回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of the regression model of fibrinolytic enzyme

注：“*”表示P<0.05；“**”表示P<0.01。

兩者模型的P<0.05，表示可用該模型分析。失擬項的P>0.05，表示擬合較好，可用其替代真實點進行分析。由表4和表5可知，氨基酸態氮的響應值與溫度、接種量關系較小，與時間關系較大。而豆豉纖溶酶的響應值與溫度、時間、接種量、時間×接種量、時間×時間、接種量×接種量顯著相關，由F值可以看出，以豆豉纖溶酶酶活為響應值影響水豆豉發酵的因素從大到小依次為：發酵溫度>發酵時間>接種量。

2.2.2 響應面分析

水豆豉各發酵條件對豆豉纖溶酶活性的影響見圖4～圖6。

圖4 發酵時間與發酵溫度交互作用 對豆豉纖溶酶活性的響應面曲線Fig.4 Response surface plot of interaction between fermentation time and fermentation temperature to fibrinolytic enzyme activity of fermented soya beans

注：固定水平為接種量0.1%。

由圖4可知，發酵溫度較發酵時間坡度更為陡峭，發酵溫度的影響大于發酵時間。

圖5 發酵溫度與接種量交互作用對豆豉纖溶酶 活性的響應面曲線Fig.5 Response surface plot interaction between fermentation temperature and inoculation amount to fibrinolytic enzyme activity of fermented soya beans

注：固定水平為發酵時間5 d。

由圖5可知，發酵溫度與接菌量的交互作用不明顯。

圖6 發酵時間與接種量交互作用對豆豉纖溶酶 活性的響應面曲線Fig.6 Response surface plot interaction between fermentation time and inoculation amount to fibrinolytic enzyme activity of fermented soya beans

注：固定水平為發酵溫度35 ℃。

由圖6可知，等高線為橢圓形，說明發酵時間與接種量的交互作用顯著。

2.2.3 響應面驗證試驗

通過響應面法建立回歸模型并進行優化分析后，最終確定的最佳發酵條件為發酵時間5 d，發酵溫度35 ℃，接種量0.01%。按照理論最佳發酵條件進行3次重復試驗，在此條件下測得的氨基酸態氮模型計算值與實際發酵產品的含量接近，豆豉纖溶酶的試驗實際值略低于理論模型計算值。

表6 驗證試驗Table 6 Verification experiment

2.3 最優發酵條件水豆豉品質檢測

陰性對照、最優條件發酵水豆豉與市售水豆豉的氨基酸態氮、總酸、還原糖含量、pH值及豆豉纖溶酶活性檢測結果見表7。

表7 氨基酸態氮、還原糖、總酸、pH值、 豆豉纖溶酶活性檢測結果Table 7 Detection results of amino acid nitrogen, reducing sugar, total acid, pH and fibrinolytic enzyme activity

注：ND表示未檢出。

由表7可知，與陰性對照相比，最優發酵水豆豉中的氨基酸態氮、總酸、還原糖含量、pH值及豆豉纖溶酶活性均有明顯上升，可見水豆豉發酵過程中，微生物作用明顯，提高了蛋白質的消化率，也產生了有營養價值的豆豉纖溶酶。最優條件發酵水豆豉的豆豉纖溶酶活性約為市售水豆豉的400倍，但是氨基酸態氮含量和還原糖含量仍較低，提示水豆豉的發酵仍不夠充分。

3 結論

用貝萊斯芽孢桿菌接種黃豆發酵水豆豉，經單因素法發酵試驗對五水平的發酵溫度、發酵時間和接菌量進行測定后，將發酵條件范圍縮小至發酵時間3～5 d，發酵溫度35～40 ℃，接菌量0.01%～0.1%。根據響應面法Box-Behnken模型按照三因素三水平設計獲得17種發酵條件進行試驗，經優化分析后最終確定的最優發酵條件為：時間5 d，溫度35 ℃，接種量0.01%。最終發酵產物初步符合提高營養價值的要求，但在發酵程度上仍有一定的改進空間。