響應面法優化藜麥中生物堿的提取工藝

劉樹興，李浩恒，任益平

(陜西科技大學 食品與生物工程學院，西安 710021)

藜麥又稱南美藜、奎藜等。原產于南美安第斯山脈的高原地區。相比于其他谷物，藜麥中蛋白質含量高達12%～23%[1]，且富含人體必需的9種氨基酸，其中賴氨酸含量達到4.5%～7.0%，遠高于大米和小麥。鈣、鎂、鋅、鐵等礦物質的含量均高于玉米和小麥，可溶性鐵的含量幾乎達到尋常谷物的2倍[2]。由于其豐富的營養價值，在國際上被稱為“超級谷物”[3]，已用于面包、面條和調味品的加工中[4]。目前在我國的西藏、青海、四川、陜西等地多有種植。

生物堿類物質主要來源于雙子葉植物，如黎科、罌粟科[5，6]、小檗科等。藜科植物含有喹喏里西定類生物堿和酰胺類生物堿[7]。其具有抗菌、抗腫瘤、降血壓、穩定神經等作用[8]。除此之外，生物堿還是一些香辛料植物的有效成分[9]。前人在文殊蘭、苦豆子、菊葉香黎、花椒、白屈菜等中進行了生物堿的提取與含量測定[10-14]，結果表明，文殊蘭中提取率最低，為3.422 mg/g，白屈菜中提取率最高，為19.2 mg/g。有關藜麥生物堿的研究國內報道甚少，為開發利用藜麥資源，本試驗對藜麥生物堿的提取方法進行了探索，以期為藜麥生物堿類物質的開發提供參考。

1 材料

1.1 試驗試劑

藜麥：產自四川阿壩州金川縣；鹽酸小檗堿標品：上海源葉生物科技有限公司；三氯甲烷、甲醇、氨水、無水乙醇、硅鎢酸等試劑：均為分析純。

1.2 儀器

CS-700型高速多功能粉碎機 永康市天祺盛世工貿有限公司；CP213型電子分析天平 奧豪斯儀器(常州)有限公司；KQ-300B型超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；101-1AB型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；SHB-III S型循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；UV-1800型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；RE52CS-1型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

2 方法

2.1 標準溶液的制備

對賈琦珍等[15]的方法進行修改，準確稱取鹽酸小檗堿對照品5.0 mg置于25 mL容量瓶中， 加入甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻。準確吸取該溶液10 mL置于25 mL容量瓶中，加入95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品母液。

2.2 鹽酸小檗堿標準曲線的繪制

吸取對照品母液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL于50 mL容量瓶中，進一步用95%乙醇溶液定容，以95%乙醇為空白對照，于416 nm波長處測定其吸光度，以吸光度和鹽酸小檗堿質量濃度求得回歸方程。

2.3 藜麥生物堿得率的測定

準確稱取提取物1 mg于100 mL容量瓶中用甲醇溶解定容，準確吸取5 mL此溶液置于100 mL容量瓶中，用95%乙醇定容，在416 nm波長處測定吸光度，之后根據已得到的標準曲線計算生物堿得率。

式中：W為藜麥生物堿得率(mg/g)；X為鹽酸小檗堿濃度(μg/mL);V為稀釋液體積(mL)；N為稀釋倍數；m為生物堿總提取量(g)；M為藜麥干粉質量(g)。

2.4 藜麥生物堿的提取方法

精確稱取5.0 g藜麥干粉于碘量瓶中，加入一定體積及濃度的乙醇溶液，在300 W的超聲功率下提取一段時間，超聲后抽濾，除去脂溶性物質，再經旋轉蒸發儀濃縮，濃縮液用2%的鹽酸酸化，用1∶1體積的氯仿萃取去除雜質，水溶液用氨水調至pH 10～11，之后再用氯仿萃取，取氯仿層在50 ℃下鼓風干燥，即得藜麥生物堿總提取物。

2.5 藜麥生物堿的定性試驗

取5 mg藜麥總生物堿提取物溶解于10 mL無水乙醇中，加入硅鎢酸試劑，若出現結晶沉淀，則證明提取物中存在生物堿。

2.6 藜麥生物堿提取工藝的優化

2.6.1 單因素試驗

2.6.1.1 液料比對藜麥生物堿得率的影響

液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 (mL/g)，乙醇濃度為85%，液料混合后先靜置浸泡5 h，然后在60 ℃的條件下超聲提取40 min，研究液料比對藜麥生物堿得率的影響。

2.6.1.2 乙醇濃度對藜麥生物堿得率的影響

乙醇濃度分別為55%、65%、75%、85%、95%，液料比為20∶1，液料混合后先靜置浸泡5 h，然后在60 ℃的條件下超聲提取40 min，研究乙醇濃度對藜麥生物堿得率的影響。

2.6.1.3 提取溫度對藜麥生物堿得率的影響

提取溫度分別為40，50，60，70，80 ℃，乙醇濃度為85%，液料比為20∶1，液料混合后先靜置浸泡5 h，然后超聲提取40 min，研究提取溫度對藜麥生物堿得率的影響。

2.6.1.4 提取時間對藜麥生物堿得率的影響

提取時間分別為10，20，30，40，50 min，乙醇濃度為85%，液料比為20∶1，液料混合后先靜置浸泡5 h，然后超聲提取，研究提取時間對藜麥生物堿得率的影響。

2.6.2 提取工藝響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，根據響應面試驗設計原理，選取液料比、乙醇濃度、提取溫度3個因素為試驗因素，以藜麥生物堿得率為響應值，設計三因素三水平共17個試驗組的響應面試驗，采用Design Expert 8.0.6軟件進行分析，得到模型回歸方程，來確定藜麥生物堿的最佳提取工藝參數。響應面因素水平見表1。

表1 響應面試驗水平和因素表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

3 結果與分析

3.1 藜麥生物堿的定性試驗

在提取的藜麥生物堿配成的溶液中加入硅鎢酸試劑，結果有明顯的結晶型沉淀出現，說明此提取物中有生物堿存在。

3.2 鹽酸小檗堿標準曲線的繪制

以鹽酸小檗堿為標品繪制鹽酸小檗堿標準曲線(見圖1)，得到回歸方程為：y=0.104x+0.003，相關系數R2=0.999，說明具有良好的線性關系。

圖1 鹽酸小檗堿標準曲線Fig.1 Standard curve of berberine hydrochloride

3.3 單因素試驗

3.3.1 液料比對藜麥生物堿得率的影響

圖2 液料比對藜麥生物堿得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the yield of quinoa alkaloids

由圖2可知，其他條件一定時，液料比在10∶1～ 20∶1(mL/g)范圍內，藜麥生物堿得率隨液料比增大而增大；在此之后，當液料比繼續增大時，生物堿得率呈減少趨勢，說明溶解的生物堿達到飽和狀態，從節約資源角度考慮，選擇15∶1～25∶1 (mL/g)為液料比研究范圍。

3.3.2 乙醇濃度對藜麥生物堿得率的影響

由圖3可知，其他條件一定時，藜麥生物堿得率在開始時持續增加，當乙醇濃度達到85%時，藜麥生物堿得率達到了最大值，之后再增加乙醇濃度時生物堿得率反而減少，說明高濃度的乙醇會影響生物堿的溶出。所以選擇75%～95%作為乙醇濃度研究范圍。

圖3 乙醇濃度對藜麥生物堿得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of quinoa alkaloids

3.3.3 提取溫度對藜麥生物堿得率的影響

圖4 提取溫度對藜麥生物堿得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield of quinoa alkaloids

由圖4可知，其他條件一定時，當溫度小于60 ℃時，隨著溫度的增加，藜麥生物堿得率持續增加，之后，隨著溫度的繼續增加，藜麥生物堿得率呈現減小的趨勢。因此，選擇50～70 ℃作為提取溫度研究范圍。

3.3.4 提取時間對藜麥生物堿得率的影響

由圖5可知，其他條件一定時，隨著提取時間的增加，藜麥生物堿得率持續升高，當提取時間達到40 min之后，藜麥生物堿得率出現了上下波動，在40，50，60 min的提取時間下，藜麥生物堿得率差別不顯著。說明40 min后提取時間不再是藜麥生物堿得率的顯著影響因素，為節約時間，提取時間選擇40 min。

圖5 提取時間對藜麥生物堿得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the yield of quinoa alkaloids

3.4 響應面試驗結果

3.4.1 響應面試驗設計及結果

利用Design Expert 8.0.6軟件進行數據擬合，試驗設計與結果見表2。

表2 試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results

3.4.2 模型的建立與顯著性檢驗

利用Design Expert 8.0.6軟件對響應面試驗結果進行多元回歸擬合，得到藜麥生物堿得率(Y)對自變量液料比(A)、提取溫度(B)、乙醇濃度(C)的二元多項回歸模擬方程：

Y=2.96+0.039A+0.11B+0.16C-0.16AB+0.055AC-0.26BC-0.54A2-0.30B2-0.52C2。

表3 響應面數據分析表Table 3 Response surface data analysis

注：“*”表示P<0.05，差異顯著；“**”表示P<0.01，差異高度顯著；“***”表示P<0.001，差異極顯著。

由表3可知，該模型的P值<0.001，表示回歸方程極其顯著，失擬項的P值為0.0976，不顯著，表明該模型能夠很好地擬合試驗數據。回歸方程的決定系數R2=0.9681，調整決定系數RAdj2=0.9271，說明該擬合方程與實際情況之間差距較小，反映出了響應值與各因素之間不是簡單的線性關系。通過擬合方程，可以得到各個因素之間存在一定的交互作用，其中B、C、AB均呈顯著影響(P<0.05)，BC、B2呈高度顯著影響，A2、C2呈極顯著影響，A、AC均不顯著。

從單因素水平看，得出的影響順序為：C(乙醇濃度)>B(提取溫度)>A(液料比)。各交互作用對藜麥生物堿得率的影響順序為：BC>AB>AC。

3.4.3 響應面優化分析

響應面曲面圖和等高線圖由Design Expert 8.0.6軟件繪制，各因素交互作用的響應面曲線圖和等高線圖，見圖6。

圖6 各因素交互作用對藜麥生物堿得率影響的 響應面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour maps of the interaction of various factors on the yield of quinoa alkaloids

由圖6可知，乙醇濃度和液料比的交互作用對藜麥生物堿得率的影響顯著，曲面呈鐘罩形，而乙醇濃度和提取溫度對藜麥生物堿得率的影響較小，圖中曲面較平滑。藜麥生物堿得率隨乙醇濃度及液料比呈現由低到高再降低的趨勢，藜麥生物堿得率在合適的乙醇濃度及液料比下具有極大值，該值存在于相應曲面的頂部，通過軟件對模型極值求解以及對等高線的分析可得最佳提取條件：液料比20.11∶1(mL/g)，提取溫度61.34 ℃，乙醇濃度86.16%，提取時間40 min，在此條件下藜麥生物堿的最大理論得率為2.97 mg/g。考慮實際操作，最終確定最佳提取工藝條件為：液料比20∶1 (mL/g)，提取溫度61 ℃，乙醇濃度86%，提取時間40 min，在此條件下進行3次平行試驗，藜麥生物堿的平均得率為2.89 mg/g，與預測值誤差為2.6%，因此可以證明響應面優化試驗具有合理性。

4 結論

由響應面試驗可知，藜麥生物堿的最佳提取工藝條件為：液料比20∶1(mL/g)，提取溫度61 ℃，乙醇濃度86%，提取時間40 min，在此條件下藜麥生物堿得率為2.89 mg/g，與模型預測值相近，說明優化后的提取工藝對藜麥生物堿的提取具有一定的指導意義。