快速溶劑萃取法在靈芝多糖提取中的應用

王宇晴，牛雯穎，劉松梅*，鄭春英*

(1.黑龍江大學 農業微生物技術教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2.黑龍江大學 生命科學學院 黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，哈爾濱 150080)

靈芝(Ganodermalucidum)，著名的食藥用真菌[1]，具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗氧化等作用[2-5]，有著悠久的應用歷史[6]。隨著科技水平的提高，各種生產技術的應用，使得靈芝產量不斷增加，現已不僅能滿足于藥品、功能性保健食品的生產[7]，還可作為基料被制作成各種功能性復合調味品，如靈芝醬油、靈芝醋等，深受廣大消費者喜愛[8]。

靈芝的主要活性成分為多糖、三萜、生物堿、芳香類成分等[9]，其中的研究熱點是多糖成分。關于多糖的提取，目前應用較多的是熱水提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、酶法、高壓熱水提取法等[10-13]，上述方法存在著耗時、溶劑消耗大、提取率低等缺點。快速溶劑萃取法具有自動化程度高、溶劑用量少、耗時短的特點，現已在食品安全檢測領域得到廣泛的應用[14]。

本文采用快速溶劑萃取法對市售靈芝子實體中多糖成分進行提取，并采用高效毛細管電泳法對其進行單糖組分分析，為功能性復合調味品中靈芝多糖的快速提取及分析提供了新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

靈芝樣品：購于哈爾濱人民同泰藥店，經黑龍江大學生命科學學院鄭春英教授鑒定為靈芝(Ganodermalucidum)。

樣品脫脂處理：脫脂溶劑為95%乙醇，料液比1∶8，回流2 h，棄去濾液，烘干藥渣，即得脫脂供試品，備用。

PMP：分析純，天津市光復精細化工研究所；葡萄糖：供含量測定用，純度>99.8%，Amresco；甘露糖、半乳糖、木糖對照品：均購自Sigma公司，純度為99%；其他試劑：均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

P/N 10503 型 美國Applied Separations公司；1229-HPCE高效毛細管電泳儀 北京新技術應用研究所；25 μm×42 cm石英毛細管柱 河北永年光學纖維廠。

1.2 方法

1.2.1 多糖含量的測定

采用蒽酮-硫酸法[15]。葡萄糖對照品標準曲線的繪制參閱文獻[16]。

1.2.2 單因素試驗

ASE各影響因素的選擇及設定參閱文獻[17]。

1.2.2.1 ASE萃取溫度的篩選

精密稱取1.1.1項下脫脂樣品3.0000 g，置于ASE萃取池中，設定ASE的提取壓力為90 Pa，提取時間為20 min，循環次數為2次，在不同溫度下，制備多糖萃取液，合并萃取液，采用1.2.1項的方法測定多糖含量。

1.2.2.2 ASE萃取壓力的篩選

精密稱取1.1.1項下脫脂樣品3.0000 g，置于ASE萃取池中，設定ASE的提取時間為20 min，循環次數為2次，提取溫度為100 ℃，在不同壓力下，制備多糖萃取液，合并萃取液，以下步驟同1.2.2.1。

1.2.2.3 ASE萃取時間的篩選

精密稱取1.1.1項下脫脂樣品3.0000 g，置于ASE萃取池中，設定ASE的提取壓力為90 Pa，循環次數為2次，提取溫度100 ℃，根據不同的提取時間，制備多糖萃取液，將合并萃取液，以下步驟同1.2.2.1。

1.2.2.4 ASE循環次數的篩選

精密稱取靈芝脫脂樣品3.0000 g，置于ASE萃取池中，設定ASE的提取壓力為90 Pa，提取時間為20 min，提取溫度為100 ℃，根據不同的循環次數制備多糖萃取液，合并萃取液，以下步驟同1.2.2.1。

1.2.3 正交試驗

在單因素試驗基礎上，確定正交試驗的影響因素，按照L9(34)正交表安排試驗，因素水平表見表1。

表1 L9(34)正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal experiment

1.2.4 驗證試驗

采用所篩選出的最佳提取條件對靈芝脫脂樣品中的多糖成分進行提取，并與傳統熱回流提取法進行對比分析。

1.2.5 靈芝多糖中的單糖組成分析

靈芝多糖的水解及衍生化參閱文獻[18]。單糖組成分析參閱文獻[19]，采用高效毛細管電泳法。電泳條件：毛細管柱(25 μm×42 cm)；檢測波長：254 nm；pH為9.5的80 mmol/L硼砂緩沖體系；分離電壓為18 kV；進樣時間為25 s。

分別精密稱取1.1.1項下4種單糖對照品各100 mg，以水制成10 mg/mL的4種單糖對照品液，備用。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的繪制結果

根據分析測定結果計算葡萄糖對照品線性方程為：Y=7.4450X-0.0061， r=0.9999。說明葡萄糖對照品在0.02～0.10 mg/mL與吸光值呈現良好的線性關系。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 ASE萃取溫度的篩選結果

設定不同的ASE萃取溫度，測定不同的萃取溫度下靈芝多糖含量的動態變化，結果見圖1。

圖1 不同ASE萃取溫度對靈芝多糖含量的影響Fig.1 Effect of different ASE extraction temperatures on the content of Ganoderma lucidum polysaccharides

由圖1可知，隨著ASE萃取溫度的增加，靈芝多糖的提取率也隨之增加，當萃取溫度達到110 ℃時靈芝多糖含量達到最大，再增加萃取溫度，其對提取率的影響并不顯著，上述結果表明，隨著萃取溫度的增高，有助于靈芝多糖的溶出，但溫度過高也可導致多糖的降解，因此，ASE的最佳萃取溫度為110 ℃。

2.2.2 ASE萃取壓力的篩選結果

ASE萃取壓力是影響靈芝多糖含量的一個重要因素，設定不同的ASE萃取壓力，測定不同的萃取壓力下靈芝多糖含量的動態變化，結果見圖2。

圖2 不同ASE萃取壓力對靈芝多糖含量的影響Fig.2 Effect of different ASE extraction pressures on the content of Ganoderma lucidum polysaccharides

由圖2可知，隨著萃取壓力的增加，靈芝多糖的含量也隨之增長，當達到100 Pa時，靈芝多糖的提取率達到最高值，繼續增加萃取壓力，靈芝多糖的含量則出現下降的趨勢，這可能是由于壓力的加大，促進了多糖的分解。因此，最佳萃取壓力設定為100 Pa。

2.2.3 ASE萃取時間的篩選結果

分別測定不同ASE萃取時間對靈芝多糖含量的影響，結果見圖3。

圖3 不同ASE萃取時間對靈芝多糖含量的影響Fig.3 Effect of different ASE extraction time on the content of Ganoderma lucidum polysaccharides

由圖3可知，隨著ASE萃取時間的增長，靈芝多糖的含量也隨之增長，在20 min后增長趨勢逐漸減緩，這是由于萃取液中多糖含量趨于平衡，繼續延長萃取時間對多糖含量的影響不明顯，并且時間的延長還可導致多糖降解，故選擇萃取時間為20 min。

2.2.4 ASE循環次數的篩選結果

設定不同的ASE循環次數，測定其對靈芝多糖含量的影響，結果見圖4。

圖4 不同ASE循環次數對靈芝多糖含量的影響Fig.4 Effect of different ASE cycle times on the content of Ganoderma lucidum polysaccharides

由圖4可知，隨著循環次數的增加，靈芝多糖的提取率增長并不明顯，從而說明循環次數不是靈芝多糖提取過程中的主要影響因素。并且，多次循環萃取，不僅使提取時間延長，還可能導致多糖的降解，故設定ASE循環次數為2次。

2.3 正交試驗結果

根據單因素試驗結果，確定ASE對靈芝多糖含量的影響因素為：溫度、壓力及時間，采用正交試驗法篩選靈芝多糖的最佳工藝參數，結果見表2，正交試驗結果方差分析見表3。

表2 正交試驗結果Table 2 The results of orthogonal experiment

續 表

表3 正交試驗方差分析結果Table 3 Variance analysis results of orthogonal experiment

由表2和表3可知，ASE提取靈芝多糖的最佳工藝條件為A3B1C3，即：ASE提取溫度設定為110 ℃，壓力選擇90 Pa，提取時間為25 min。說明ASE的溫度對靈芝多糖含量的影響極顯著，而ASE萃取時間和壓力對靈芝多糖含量的影響不顯著。綜合多種影響因素，最終確定靈芝多糖最佳ASE提取條件為：溫度設定為110 ℃，壓力設置為90 Pa，提取時間為20 min，循環次數為2次。

2.4 驗證試驗結果

分別采用傳統熱水提取法及所篩選的最佳ASE提取條件對靈芝中多糖進行提取，結果見表4。

表4 不同提取方法比較結果(n=3)Table 4 Comparison results of different extraction methods(n=3)

由表4可知，按照單因素試驗及正交試驗結果所篩選的ASE提取工藝提取靈芝多糖，其含量與傳統熱水提取法相比有顯著提高，并且，其提取率與正交試驗中7號試驗結果相近，從而驗證了結果的準確性。

2.5 靈芝多糖中的單糖組成分析結果

按1.2.5制備衍生化對照品混合溶液，采用HPCE法進樣，測定峰面積，繪制標準曲線，結果見表5。

表5 標準曲線測定結果Table 5 Determination results of standard curves

對所提取得到的靈芝多糖中單糖組分進行高效毛細管電泳分析，結果見圖5。

圖5 高效毛細管電泳分析結果Fig.5 Analysis results of HPCE

注：1為PMP；2為木糖；3為葡萄糖；4為甘露糖；5為半乳糖。

由圖5可知，對比混合對照品，根據其出峰時間，可以確定：靈芝多糖主要由葡萄糖、甘露糖和半乳糖組成，未檢測到木糖。經計算，靈芝多糖中單糖組成比例為葡萄糖∶甘露糖∶半乳糖為2.8063∶1.0000∶2.1910。

3 結論

靈芝子實體細胞壁結構致密，采用ASE法提取靈芝中多糖成分，借助其高溫、高壓、高效、自動化、無噪音等特點，與常用的靈芝多糖提取法相比，其提取率顯著提高。結果表明，采用ASE法提取靈芝多糖成分的最佳條件為提取溫度為110 ℃，壓力90 Pa，提取時間20 min，循環次數2次。

通常，各種功能性復合靈芝調味品在制作過程中會發生一系列的多糖降解，使得調味品中的靈芝多糖難富集、含量低；且構成多糖的單糖組分及其含量與多糖的結構、溶解性等都密切相關。本文采用ASE法可快速、高效提取靈芝多糖，同時采用HPCE法分析靈芝多糖中的單糖組成，方法成熟、靈敏度高、重現性好，因此，ASE-HPCE法適用于各種調味品中靈芝多糖的快速提取及分析檢測。