調(diào)味香料丁香精油的生物活性及其在食品保鮮中的應用研究進展

王穎，孫璐，柴冉，王娟娟，李榮*，姜子濤,2*

(1.天津商業(yè)大學 生物技術(shù)與食品科學學院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室， 天津 300134;2.天津天獅學院 食品工程學院，天津 301700)

為了防止食品腐爛變質(zhì)而危害健康，常在食品中加入一定量的食品防腐保鮮劑以延長保質(zhì)期。食品保鮮劑分為天然保鮮劑和化學合成保鮮劑，后者存在安全隱患，使用不當會嚴重危害身體健康[1]，因此研發(fā)綠色、安全的食品保鮮劑顯得尤為重要。天然保鮮劑憑借其綠色、健康、安全的特點，成為食品保鮮劑新的研究熱點。現(xiàn)階段精油已被應用于食品保鮮，丁香精油作為天然調(diào)味香料具有廣譜抗菌性，且抑菌效果通常優(yōu)于其他植物精油，于君等[2]對丁香精油的化學成分、應用等進行了綜述，但對于其生物活性的作用機理并未探討，且僅簡要介紹了果蔬與肉制品保鮮方面的應用。本文現(xiàn)著重探討丁香精油的重要生物活性——抑菌性及抗氧化性的作用機理，并對丁香精油在果蔬、肉制品、豆制品、水產(chǎn)品等方面的保鮮應用進行較為全面的綜述，最后探討了丁香精油在食品保鮮中丞待解決的問題并提出可能的解決方法。

丁香(Syzygiumaromaticum)為桃金娘科(Myrtaceae)蒲桃屬(Syzygium)植物，由于花蕾呈“丁”字形，且?guī)в袕娏业南阄叮史Q“丁香”。藥用未開放的花蕾為“公丁香”；圓形或長橢圓形的成熟果實為“母丁香”，形狀似雞舌，亦稱“雞舌香”。丁香原產(chǎn)于印度尼西亞等熱帶地區(qū)，我國海南、廣東、廣西等地亦是丁香屬植物的主要分布區(qū)。丁香為傳統(tǒng)的調(diào)味香料，同時也具有一定的藥用價值，具有補腎助陽和溫中降逆的功效，可用于治療食少吐泄、脾胃虛寒等癥狀，其主要活性成分是丁香精油[3]。

1 丁香精油的生物活性

丁香精油香氣飄逸，具有丁香花蕾清濃、溫暖、辛甜的香氣，稍有焦糖和酸甜氣息。常溫下呈透明無色或淡黃色，不溶于水，易溶于醚、醇或冰醋酸中，其主要活性成分是丁香酚，還含有萜類、苷類、有機酸類等有效成分等。公丁香精油中抑制作用最顯著的化學成分為丁香酚，中醫(yī)臨床上多以公丁香入藥，功效佳；而目前關(guān)于母丁香藥理作用的研究鮮有報道，但根據(jù)公、母丁香精油中丁香酚的含量可以推斷母丁香及其精油的抗菌消炎、抗氧化等作用略低于公丁香。丁香精油具有抑菌、抗炎、抗氧化、驅(qū)蟲等生物活性，以下對丁香精油最顯著的性質(zhì)抑菌性及抗氧化性進行詳細闡述。

1.1 丁香精油的抑菌性及其作用機理

食品腐爛的原因之一是由于微生物病原菌的污染，微生物可能導致食源性疾病的發(fā)生。丁香精油的主要活性成分丁香酚具有抑菌、抗氧化等生理活性，因此丁香精油作為天然食品防腐劑亦具有較強的抑菌活性。已有研究表明丁香能夠阻止冷卻牛肉貯藏過程中菌落總數(shù)的增加[4]；此外，丁香精油對金黃色葡萄球菌生物膜亦有較好的抑制和清除作用[5]。作為丁香精油的主要成分，丁香酚在不同實驗條件下對幾種常見食源性病原菌均表現(xiàn)出較強的抗菌活性，如丁香酚作用于大腸桿菌和痢疾桿菌的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC值)和最小殺菌濃度(minimal bactericidal concentration, MBC值)相等且均為312.5 μg/mL，作用于其他菌株MIC值和MBC值為625 μg/mL[6]。綜上，關(guān)于丁香精油強抑菌性的報道眾多[7-11]，但深入探討其抑菌機理的研究相對較少。

天然產(chǎn)物的抑菌機理通常包括物理的、化學的、物理化學的和生物化學的機理，一般是幾種高效性結(jié)果的累加或眾多因素共同產(chǎn)生影響的結(jié)果。抑菌物質(zhì)對微生物的抑制作用通常體現(xiàn)在對其細胞結(jié)構(gòu)的破壞上，比如細胞膜、細胞壁、蛋白質(zhì)、核酸及某些代謝相關(guān)的酶等[12]。丁香精油的主要抑菌機理大致有以下幾方面：破壞細胞壁和細胞膜系統(tǒng)，致使細胞裂解甚至破碎，細胞內(nèi)重要物質(zhì)損失，最終導致細菌死亡[13]；在破壞細胞結(jié)構(gòu)后進入細胞質(zhì)膜或細胞內(nèi)，抑制細菌生長所需的ATP和蛋白質(zhì)的正常合成，并改變DNA或RNA的結(jié)構(gòu)，比如丁香酚可通過形成丁香酚-DNA嵌合體改變DNA的結(jié)構(gòu)，使微生物功能改變，發(fā)揮滅菌防腐作用；降低呼吸代謝所需關(guān)鍵酶的活性，使微生物細胞呼吸過程受抑制，呼吸鏈受阻礙，導致合成代謝受阻。

為進一步揭示丁香精油的抗菌機理，有學者還分別研究了其對單增李斯特菌的細胞膜、呼吸代謝及與DNA相互作用的影響，結(jié)果顯示丁香精油會導致3個生物大分子(蛋白質(zhì)、ATP和DNA)的減少和3個胞內(nèi)酶(β-半乳糖苷酶和AKP)活性的降低，對細胞膜通透性有一定影響；抑制率和疊加率實驗證實丁香精油影響單增李斯特菌呼吸代謝的途徑為TCA途徑，且可降低TCA途徑中3個關(guān)鍵酶(異檸檬酸脫氫酶、檸檬酸合成酶和α-酮戊二酸脫氫酶)的活性，并影響代謝產(chǎn)物的含量；紫外吸收光譜結(jié)果表明丁香精油的主要成分丁香酚通過形成丁香酚-DNA嵌合體從而改變了DNA的結(jié)構(gòu)。此外，亦有研究證明丁香酚可以抑制微生物生物膜的形成，且對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細胞膜均有顯著影響[14]。

1.2 丁香精油的抗氧化性及其作用機理

食品在生產(chǎn)、加工、貯藏、運輸和銷售過程中都易發(fā)生氧化和腐敗變質(zhì)[15]。丁香精油作為我國傳統(tǒng)的植物精油，除上述抑菌作用外，在抗氧化、增香、保色、保鮮和防腐等方面均具有廣泛的活性，故有關(guān)丁香精油抗氧化性的報道屢見不鮮。例如，研究丁香、牛至以及檸檬精油和生姜提取物的混合物對Balb/c小鼠器官抗氧化狀態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)所有精油均能顯著降低小鼠肝、腦組織LPO含量，提高肝、腦脂質(zhì)抗氧化能力及肝臟抗氧化酶活性，其中丁香精油對紅細胞的生物抗氧化作用最強[16]；丁香精油可通過Novozym 435催化其酯化反應，生產(chǎn)乙酸丁香酯、丁香精油和乙酸丁香酚的抗菌和抗氧化活性測定結(jié)果表明在酯化反應前后，尤其是酯化反應后，丁香精油的抗氧化能力均很高[17]；通過化學檢測、拉曼光譜和感官評價測定丁香和肉桂精油在+4 ℃或-1 ℃冷藏條件下抑制即食豬排的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化的抗氧化作用，定期分析處理樣品和對照樣品中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化，結(jié)果顯示丁香精油比肉桂精油具有更高的抗氧化活性[18]。以上均證明了丁香精油的強抗氧化性，但上述研究僅測定了丁香精油的抗氧化活性，并未深入探討其抗氧化機理。

天然香料的成分中通常都具有還原性成分，如酚羥基、還原性雜原子、不飽和雙鍵等[19,20]。這些還原性成分單獨存在時具有抗氧化性，它們組合時亦具有抗氧化作用，而且絕大多數(shù)會產(chǎn)生協(xié)同作用，使組合后的還原性增強。一般認為，植物精油同時具有直接和間接的抗氧化性：前者為精油的某些活性成分通過阻止鏈式反應的啟動和阻斷鏈式反應的傳播兩種方法來抑制或阻斷自由基鏈式反應，即精油既可于啟動階段(Initiation)阻止自由基生成，亦可于傳播階段(Propagation)比氧化物質(zhì)更快地與過氧化自由基反應生成較為穩(wěn)定的物質(zhì)，從而導致鏈式反應減緩或被阻斷，其機制見圖1[21]；而后者為精油作為抗氧化劑本身并不直接參加抗氧化過程，但可以借助其保護氧化基質(zhì)的作用，從而提高機體的防御能力來發(fā)揮其抗氧化性。

圖1 植物精油作為抗氧化劑阻斷自由基鏈式反應示意圖Fig.1 Schematic diagram of chain reaction of blocking free radicals with plant essential oil as antioxidant

1.3 丁香精油抑菌性及抗氧化性的影響因素

綜上，丁香精油在眾多食品中均具有較好的抑菌性和抗氧化性，這促使其在食品保鮮領(lǐng)域有良好的應用前景。但由于精油本身的一些性質(zhì)缺陷，會對其抑菌性和抗氧化性造成很大的影響，比如：溫度、濃度、pH值、有機質(zhì)、提取方法等因素。

1.3.1 溫度的影響

已有研究表明，濃度為0.4%的丁香精油于37 ℃時處理細菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌)的滅活效果比21 ℃時高18～19倍，即溫度高時抑菌效果顯著增強[22]。Tomaino等[23]的研究顯示了溫度對丁香精油等多種植物精油抗氧化活性的影響，在不同溫度下(室溫，80，100，120，180 ℃)處理3 h后，隨著溫度升高至180 ℃，除肉豆蔻精油的DPPH自由基清除效果顯著升高外，丁香精油等其他精油均無顯著變化，且在上述5種溫度下丁香精油清除DPPH自由基的效果均顯著高于其他精油(丁香>肉桂>肉豆蔻>羅勒>牛至>百里香)。另有研究采用分光光度法比較了12種植物精油氣相清除DPPH自由基的能力，其中丁香精油的清除能力最強，且反應溫度從10 ℃提高到50 ℃時，丁香精油清除DPPH的效果顯著增加，清除率達到最高80.12%，實驗表明提高反應溫度利于精油活性成分的充分揮發(fā)，從而提高密閉環(huán)境中精油分壓，促使其空間濃度升高，氣相清除自由基的效率亦會提高[24]。綜上可知，提高反應溫度一般有利于丁香精油的抑菌和抗氧化活性作用。

1.3.2 濃度的影響

研究證明丁香精油的生物活性具有濃度依賴性，如體外熏蒸實驗結(jié)果表明丁香精油對番茄果實灰霉菌和采后病原菌的抑菌效果隨著高精油濃度的增加而增加，濃度為100 μL/L時效果最好；直接接觸實驗表明該抑菌效果隨著精油濃度的增加先增加后降低，1.6 mL/L時最為顯著，從而確定了丁香精油的最佳抑菌濃度。李玉邯等將醬牛肉置于不同濃度(0.05%、0.10%和0.15%)的丁香精油中浸漬后，進行真空包裝，研究菌落總數(shù)的變化和2-硫代巴比妥酸過氧化生成物(TBA)來衡量濃度對丁香精油抑菌性和抗氧化性的影響。冷藏25 d后，0.05%精油浸漬的醬牛肉菌落總數(shù)超標，而0.10%和0.15%精油浸漬的醬牛肉菌落總數(shù)仍處于標準范圍，且精油濃度越大，TBA值越低。TBA作為反映肉制品中脂肪氧化酸敗程度的合適指標，其值越大，脂肪的氧化程度越高，酸敗越嚴重。以上均說明隨著丁香精油濃度的增加，其抑菌性和抗氧化性逐漸增強。

1.3.3 pH值的影響

丁香精油的抑菌活性pH值范圍為4～6，丁香、甘草和迷迭香精油復配用于醬油防腐，除起到很好的抑菌效果外，也賦于醬油一種奇特香味，精油作為天然防腐劑在醬油或pH中性偏酸的介質(zhì)中抑菌效力優(yōu)于合成防腐劑苯甲酸鈉[25]。酸性pH值時精油抑菌活性增強，這與酸性條件下菌體本身活性降低有關(guān)，且pH值的降低可以減少精油活性成分酚類化合物所含酚羥基的電離度，增加其疏水性，從而更易結(jié)合菌體細胞膜和脂蛋白，提高抑菌活性。

1.3.4 有機質(zhì)的影響

研究顯示加入有機質(zhì)會降低丁香精油的抑菌活性，尤其牛血清蛋白(BSA)對金黃色葡萄球菌的干擾性最大，其減少細菌種群中的5個對數(shù)周期需要10 min(在無有機物存在的情況下僅需3 min)。首先，有機質(zhì)導致丁香精油的抗菌活性降低，是由于精油與有機質(zhì)之間相互作用導致精油不易被微生物吸收，無法進入菌體的細胞中破壞其結(jié)構(gòu)。其次，不同的有機質(zhì)使精油抑菌活性降低的程度不同，這是因為高濃度的蛋白質(zhì)對細菌活性產(chǎn)生顯著的干擾，故精油中所加有機質(zhì)的蛋白質(zhì)含量越高，精油抑菌性越差，反之亦然。米紅波等[26]探討了魚類血紅蛋白誘導脂質(zhì)氧化的機理：新鮮魚類富含大量血紅素鐵，隨著儲存時間的增加，血紅蛋白逐漸變性，鐵從血紅素上釋放，這些釋放的鐵離子促使生成高反應活性的自由基，最終啟動了脂質(zhì)氧化，而丁香精油中的酚類物質(zhì)可以使鐵離子還原為亞鐵離子，從而可以有效抑制水產(chǎn)品在貯藏過程中發(fā)生的由血紅蛋白誘導的脂質(zhì)氧化，由此可推斷對于血紅蛋白含量高的水產(chǎn)品，丁香精油可以更好地發(fā)揮抗氧化作用。

1.3.5 提取方法的影響

不同的提取方法所提取精油化學成分、含量和結(jié)構(gòu)有很大的不同。即使是同一種方法，提取條件(比如：加熱溫度、時間、料液比、萃取壓力等)不同，得到天然植物中活性成分的抑菌與抗氧化效果亦不相同。丁香精油主要活性成分是丁香酚、乙酰基丁香酚及β-石竹烯，故也可用其主要活性成分的含量來判斷丁香精油抑菌性和抗氧化性的差別。

眾多學者研究了不同提取方法所提取精油成分的差異，從而影響其抑菌性及抗氧化性[27，28]。比如，李鵬等比較了水蒸氣蒸餾法(hydro-distillation,HD)、微波法(microwave-assisted extraction,MAE)、超聲波提取法、溶劑提取法和超臨界CO2萃取法(supercritical fluid extraction,SFE)5種方法，發(fā)現(xiàn)SFE法具有提取溫度低、提取時間短、無溶劑殘留等優(yōu)點，且此法的精油提取率和丁香酚總含量均最高，故可推斷所得丁香精油的抑菌性及抗氧化活性均最強。Golmakani等對比了HD法和微波輔助水蒸氣蒸餾(MAHD)提取丁香精油的工藝，MAHD法的升溫速率是HD的5倍，而且MAHD法提取丁香酚含量(88.80%)稍高于HD法(87.26%)，同時使用自由基清除活性(RSA)、亞鐵離子還原抗氧化力(FRAP)、銅離子降低抗氧化能力(CuPrAc)和亞鐵離子螯合(FIC)4個指標更全面地評價所得精油的氧化性，結(jié)果顯示MAHD所得精油的抗氧化活性顯著高于HD法。Kennouche等[29]比較了HD法、MAE法和微波水蒸氣蒸餾(MAHD)3種方法提取丁香精油，結(jié)果表明MAE和MAHD技術(shù)的精油產(chǎn)率和主要活性成分含量高，故具有更好的抑菌性和抗氧化活性。Podariu等[30]對比了HD和MAE兩種方法提取丁香精油得率和主要活性成分，雖然HD法的得率(15%)低于MAE法(20%)，但其主要成分丁香酚含量(80.12%)卻高于MAE法(78%)。此結(jié)論與Kennouche和Golmakani的研究結(jié)果有差異，通常情況下，MAE法由于微波作用，其提取率及有效成分含量應高于傳統(tǒng)的HD法，微波萃取是丁香精油更為有效的提取方式，且可通過影響精油的活性成分從而影響丁香精油的抑菌性與抗氧化性。故不同提取方法對精油的提取率及活性成分都有很大的影響，從而影響精油的抑菌性及抗氧化性。即便是同一種提取方法，工藝不同，精油的抑菌性及抗氧化性也會有差別。

綜上所述，丁香精油的生物活性及其作用機理、影響因素見圖2。

圖2 丁香精油的生物活性及其作用機理、影響因素Fig.2 Bioactivities, action mechanisms and influencing factors of clove essential oil

2 丁香精油于食品保鮮中的應用

2.1 果蔬保鮮中的應用

陳梅通過丁香精油番茄體外抑菌實驗和番茄果實采后的防腐實驗，證明了丁香精油既可以在體外條件下抑制番茄采后病原菌的生長，又可有效抑制番茄果實采后灰霉病的發(fā)生。Rizwana[31]經(jīng)實驗證明丁香精油對香蕉炭疽病病原體具有殺菌和抑菌作用。Torre等[32]評估了丁香精油預防番茄枯萎的效果，研究發(fā)現(xiàn)丁香精油能抑制菌絲生長和分生孢子萌發(fā)，效果顯著。由此可知，丁香精油在果蔬保鮮方面應用的價值，故丁香精油可成為果蔬化學合成保鮮劑的潛在替代品。

2.2 肉制品保鮮中的應用

丁香精油對老北京肉肚中葡萄球菌、假單胞菌和環(huán)絲菌屬均有較好的抑菌效果；丁香、肉桂及其復配精油處理香腸，經(jīng)比較得出按1∶1復配的精油的抑菌效果最佳，貯藏期間菌落總數(shù)顯著低于普通香腸，pH值始終較低，可延長香腸的貨架期[33]；若使用丁香精油對醬牛肉進行浸漬，測試了處理后醬牛肉的TBA值，證明了丁香精油的添加一定程度上抑制了醬牛肉的脂質(zhì)氧化，抑制了醬牛肉的菌落總數(shù)，并可提高醬牛肉的抗氧化性能。以上均顯示丁香精油的添加可以一定程度上提高肉類食品的品質(zhì)和抑菌及抗氧化性能。

2.3 豆制品保鮮中的應用

Cui等通過實驗研究了丁香精油在內(nèi)酯豆腐、鹽鹵豆腐、嫩豆腐以及老豆腐中的抑菌特性，精油的抑菌率在24 h后可高達99.9999%，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果均很顯著。林琳等[34]研究丁香精油于4種豆制品(豆腐、豆干、素雞、百葉)中的保鮮作用，1～2 d時，加入丁香精油的培養(yǎng)基上金黃色葡萄球菌的菌落數(shù)明顯低于對照組，但3 d之后，兩種培養(yǎng)基的菌落數(shù)幾乎無差別，說明丁香精油對豆制品可以達到保鮮作用，但保質(zhì)期較短，這亦和丁香精油的穩(wěn)定性有關(guān)。綜上，丁香精油作為食品添加劑，在短時間內(nèi)減少導致豆類食品腐敗的微生物數(shù)量是可實現(xiàn)的。

2.4 水產(chǎn)品保鮮中的應用

Dehghani等[35]利用含丁香精油和百里香精油乳劑的波斯氏全口香糖涂層(FGC)來延長冷藏虹鱒魚片的貨架期，結(jié)果表明在FGC中添加丁香精油可顯著提高魚片的品質(zhì)。Binsi等[36]研究了添加丁香精油的涂層對冷藏鯰魚片氧化穩(wěn)定性和質(zhì)構(gòu)穩(wěn)定性的影響，在冷藏過程中丁香精油包衣能更有效地保護魚片的質(zhì)構(gòu)，延緩魚片的脂質(zhì)氧化。Rocha等[37]研究了丁香精油對牙鲆魚片瓊脂膜性能和貨架期的影響，對涂膜牙鲆魚片在5 ℃下貯藏15 d的微生物及理化性質(zhì)進行了監(jiān)測，結(jié)果表明丁香精油膜表現(xiàn)出更低的總揮發(fā)堿和pH值，且更顯著地延緩了產(chǎn)H2S的微生物生長。

3 丁香精油于食品保鮮中丞待解決的問題

丁香精油雖廣泛應用于食品保鮮行業(yè)，但其成分均為芳香性易揮發(fā)物質(zhì)，用于食品保鮮時容易揮發(fā)，難以維持長久的防腐效果，且精油溶解度小，不易貯藏和添加。此外，丁香精油應用于食品保鮮中，用量少時可能對抑制細菌無效，無法維持食品的品質(zhì)；用量大時，雖能抑制細菌增長乃至殺死細菌，但其濃郁的香味也可能影響甚至改變食物原本的風味。微膠囊技術(shù)[38]作為一種新興包封技術(shù)，可保護被封裝物質(zhì)，避免在生產(chǎn)、儲存和加工期間的不良反應，彌補其原有的缺陷，實現(xiàn)控制釋放，隔離與食品物料之間的反應，亦可提高溶解度和耐濕性。通常，微膠囊由核心材料(填充物)和壁(涂層)組成(見圖3中A)；精油由壁材包裹形成微膠囊后，可在不同的化學、物理或者機械的影響因素下進行控制釋放見(見圖3中B)。壁材料決定了微膠囊的穩(wěn)定性、加工效率和對芯材的保護程度。脂質(zhì)體是由磷脂分散在水中自聚集形成的具有雙分子層結(jié)構(gòu)的小囊泡的一種人工細胞膜。趙呈婷[39]通過納米脂質(zhì)體包裹丁香精油來顯著提高精油的穩(wěn)定性和水溶性，并制備出智能的α-溶血素刺激響應型丁香精油納米脂質(zhì)體來提高精油于食品應用中的控釋保鮮作用。李丁等[40]采用β-環(huán)糊精(β-CD)包埋丁香精油制備抗菌微膠囊，并研究了其抗菌性能。β-CDs的微膠囊要比普通的微膠囊更具優(yōu)勢，β-CDs的微膠囊溶于水時不會析出丁香精油，而普通的微膠囊僅能解決精油分散的問題，若溶于水則會析出丁香精油。客體物質(zhì)(Guest)被β-CDs包埋后，可提高光照、溫度和酸堿的穩(wěn)定性，并能提高其溶解度、揮發(fā)性等各種理化性質(zhì)，尤為重要的是β-CDs對人體無毒害作用且成本低廉、簡單易得。

圖3 精油微膠囊(A)及精油控制釋放(B)示意圖Fig.3 Schematic diagram of essential oil microcapsule (A) and essential oil controlled release (B)

4 總結(jié)和展望

丁香精油天然、安全，已被眾多國家和地區(qū)作為防腐保鮮劑應用于食品行業(yè)。其防腐效果甚至超過化學合成的食品防腐劑，氣味清淡，只要很低的濃度便具有很強的抑菌和抗氧化效果，可以減少對食品風味的影響。丁香精油和其他植物精油的抑菌效果相比作用強，這預示著其作為天然防腐劑具有顯著優(yōu)勢。目前，丁香精油的應用一般為直接用于食品的保鮮，但由于其易揮發(fā)、溶解度小，導致其不易貯藏和添加，從而限制了其應用。而丁香精油結(jié)合其他材料提高其穩(wěn)定性、擴大其應用范圍的研究是今后值得關(guān)注的問題。因此，丁香精油作為食品防腐劑還有極大的探索空間和應用空間。