鮑曼不動桿菌莢膜通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路促進鼠巨噬細胞自噬和凋亡

韓長鳴，戴曉玥，段前梅，仇圣剛，石立新，夏雯，鄒治情，Dinsh Kumar K, 吳亮，陰晴，許化溪

(1.江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013；2.揚州市江都人民醫院神經內科，江蘇 揚州 225200；3.江蘇大學附屬醫院檢驗科，江蘇 鎮江 212001)

鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)屬于機會致病菌，是目前臨床中重要的多重耐藥菌，廣泛存在于醫院環境中，可引起免疫力低下患者的嚴重感染。近年來，住院患者中該菌的分離率上升迅速，并且耐藥性也呈快速上升趨勢，甚至出現了對碳青霉烯酶和多粘菌素耐藥的“超級細菌”[1]。現有的研究多關注于該菌迅速獲得耐藥性的機制，但對其毒力因子和致病機制研究卻極少關注，臨床工作對于嚴重鮑曼不動桿菌感染患者仍缺乏有效治療手段，患者死亡率極高[2]。

巨噬細胞是人體第一道免疫屏障的重要組成，也是重要的抗原遞呈細胞，在抵抗鮑曼不動桿菌感染中發揮重要作用[3]。細胞的自噬和凋亡都屬于程度性死亡，均可以由病原體感染所調控，是病原體逃避宿主免疫系統清除的重要手段。病原體通過各種細胞信號通路調控宿主巨噬細胞自噬和凋亡，其中，PI3K/Akt/mTOR信號通路是目前研究的熱點[4]。PI3K/Akt/mTOR信號通路是重要的細胞生存通路之一，在促進細胞增殖、運動、侵襲和轉移，以及抑制細胞自噬和凋亡中發揮重要作用，多種病原體在宿主體內增殖和致病過程均與其激活或抑制密切相關[5]。鮑曼不動桿菌的侵入也可以誘導宿主巨噬細胞的自噬和凋亡，但其誘導機制目前仍不清楚。本研究探討鮑曼不動桿菌調控鼠巨噬Raw 264.7細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路活化，及其誘導Raw 264.7細胞自噬和凋亡的相關機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細胞株 鮑曼不動桿菌分離于江蘇大學附屬醫院患者痰液，分純菌株凍存于15%脫脂牛奶中；鼠巨噬Raw 264.7細胞購于上海中科院細胞庫；哥倫比亞瓊脂培養基購自青島海博生物技術有限公司；羊血購自貝瑞特生物公司；剛果紅染料購自上海生工公司；結晶紫染液購自北京索萊寶生物公司；RPMI 1640培養基(HyClone公司)；胰蛋白酶(1 ∶250)、胎牛血清(美國Gbico公司)；Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒購自南京Vazyme公司；內參抗體GAPDH抗體、HRP標記羊抗兔和抗鼠抗體、兔抗鼠一抗p-PI3K和PI3K抗體，p-Akt和Akt抗體，以及p-m-TOR和m-TOR抗體均購自武漢博士德公司；磷酸化酶抑制劑(美國Roche公司)；其他化學試劑均購自上海生工公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鮑曼不動桿菌莢膜厚度檢測 采用吳亮等[6]剛果紅染色法染色臨床分離的鮑曼不動桿菌。具體方法如下，取剛果紅染料0.8 g溶于20 mL蒸餾水中備用，另配5% HCl用于脫色。將剛果紅染液與胎牛血清按4 ∶1比例混合后取1滴滴加于玻片上，取血平板上過夜生長的鮑曼不動桿菌菌落與上述液體充分混合，按推制血片的方法制成推片，自然干燥。滴加數滴5% HCl 室溫下脫色1 min，經流水沖洗，再加結晶紫染液1 min，洗水沖洗，空氣中干燥后鏡檢。根據鏡檢結果選擇出兩株莢膜厚度差異明顯的菌株，分別命名為厚莢膜菌株(Ab-H株)和薄莢膜菌株(Ab-B株)用于后續實驗。

1.2.2 Raw 264.7細胞培養和細菌感染 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液培養Raw 264.7細胞，待細胞生長融合至70%～80%時消化細胞，接種于6孔板，置于37℃ 5% CO2環境中培養。Ab-H株和Ab-B株分別于LB培養基中擴增培養，經10 h振搖培養后獲得新鮮菌液，以無菌PBS洗滌并調整細菌密度為1×109/mL[D(600 nm)=1]。在生長融合至70%的Raw 264.7細胞中分別加入鮑曼不動桿菌Ab-H株和Ab-B株(細菌數量 ∶細胞數量=10 ∶1)，繼續置于37℃ 5% CO2環境中培養。于感染后1 h、3 h和6 h時收集細胞，用于免疫印跡檢測和流式細胞術分析。

1.2.3 免疫印跡檢測 免疫印跡檢測PI3K、Akt和mTOR在鮑曼不動桿菌Ab-H株和Ab-B株感染后的磷酸化水平，以及自噬相關蛋白LC-3和Beclin-1表達水平。檢測步驟如下：收集細胞1×106個，以1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入無菌PBS洗滌3次；在細胞沉淀中加入100 μL RIPA裂解液，以及PMSF(100 mmol/L)1 μL、Na3VO4(200 mmol/L)0.5 μL、NaF(0.5 mmol/L)0.2 μL、磷酸化酶抑制劑15 μL，細胞懸浮混勻，在冰上靜置20 min。于4℃中以15 000 r/min離心15 min；取上清液，采用BCA法測定樣本蛋白濃度。行SDS-PAGE，120 V電泳2 h；350 mA恒流轉印90 min，使蛋白轉移至PVDF膜；5%脫脂奶粉封閉2 h；所有一抗稀釋度為1 ∶100，內參GAPDH抗體稀釋度為1 ∶1 000，4℃下孵育過夜；次日以TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min；二抗采用羊抗兔HRP-IgG，抗體稀釋度為1 ∶2 000，于室溫下孵育1 h；以TBST緩沖液充分洗滌3次，每次10 min；滴加ECL底物顯色液，避光顯色1 min；照相記錄并以儀器自帶Quantity One軟件分析目的條帶灰度。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率和活性氧生成 Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡，嚴格按照試劑盒操作說明書進行。先以不含EDTA的胰酶細胞消化液消化細胞，精確計數1×106個細胞，以1 500 r/min離心5 min；取細胞沉淀，加入195 μL Annexin-V-FITC結合緩沖液重懸細胞，加入5 μL Annexin-V-FITC和10 μL PI溶液，置于37 ℃溫箱避光孵育15 min后立即行流式細胞術檢測。DCFH-DA熒光探針法檢測細胞活性氧時，嚴格按照試劑盒操作說明書進行。以無血清細胞培養液按1 ∶1 000稀釋DCFH-DA熒光探針原液，其終濃度為10 μmol/L，胰酶消化收集細胞并調整細胞密度為1×106個/mL。各組細胞中加入DCFH-DA熒光探針工作液，37 ℃中孵育20 min。孵育結束后，以無血清細胞培養液洗滌細胞3次，采用流式細胞儀檢測細胞DCF熒光強度。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 鮑曼不動桿菌莢膜厚度檢測

鮑曼不動桿菌經剛果紅染色后，細菌菌體染成紫黑色，背景染成橘紅色，細菌莢膜不著色，可以很清晰地分辨細菌莢膜厚度(圖1)。染色重復3次并在顯微鏡下反復觀察比較，選擇出兩株莢膜厚度差異顯著的鮑曼不動桿菌，分別命名為厚莢膜株(Ab-H株)和薄莢膜株(Ab-B株)，用于后續實驗。

圖1 剛果紅染色法檢測鮑曼不動桿菌莢膜

2.2 不同莢膜厚度鮑曼不動桿菌誘導Raw 264.7細胞自噬和凋亡比較

Ab-H株和Ab-B株均可誘導Raw 264.7細胞不同程度的自噬和凋亡(圖2和圖3)。Raw 264.7細胞自噬相關蛋白LC-3Ⅱ在感染后1 h時未被檢出，但隨感染時間延長其表達量在各組細胞均增加。感染后3 h和6 h時，Ab-B組和Ab-H組細胞LC-3Ⅱ表達量顯著高于對照組(3 h，Ab-B組：t=-6.24, Ab-H組：t=-6.76,P均<0.05；6 h，Ab-B組t=-4.27, Ab-H組t=-10.73,P<0.05)，Ab-B組和Ab-H組細胞LC-3Ⅱ表達量差異無統計學意義(3 h，t=-1.76,P>0.05；6 h，t=-3.87,P>0.05)。兩株細菌感染Raw 264.7細胞1 h、3 h和6 h時，自噬相關蛋白Becline-1表達量和細胞凋亡率均顯著高于對照組(P均<0.05)，且Ab-H組相關蛋白表達量和細胞凋亡率均明顯高于Ab-B組(P均<0.05)。

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與Ab-B組比較

同一時間內，*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與Ab-B組比較

2.3 不同莢膜厚度鮑曼不動桿菌誘導Raw 264.7細胞活性氧生成增加

兩株鮑曼不動桿菌感染后1 h、3 h和6 h時，Raw 264.7細胞活性氧生成量均較對照組顯著增加(P均<0.05)，且Ab-H組活性氧生成量顯著高于Ab-B組(1 h，t=-9.25,P<0.05；3 h，t=-13.61,P<0.05；6 h，t=-11.39,P<0.05)。見圖4。

2.4 不同莢膜厚度鮑曼不動桿菌抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的活化

兩株不同莢膜厚度鮑曼不動桿菌感染Raw 264.7細胞后，細胞PI3K、Akt和mTOR的磷酸化水平顯著受到抑制，且抑制作用隨著時間延長而增強(P<0.05)。以Ab-H株作用Raw 264.7細胞1 h和3 h時，細胞PI3K磷酸化水平顯著低于Ab-B株作用(1 h，t=3.20，P<0.05；3 h，t=3.57，P<0.05)，作用6 h時Ab-B組和Ab-B組細胞PI3K磷酸化水平差異無統計學意義(t=0.346，P>0.05)；以Ab-H株作用Raw 264.7細胞3 h時，細胞Akt磷酸化水平顯著低于Ab-B株作用(t=3.01，P<0.05)，1 h和6 h時Ab-B組和Ab-B組細胞Akt磷酸化水平差異無統計學意義(P均>0.05)；以Ab-H株作用Raw 264.7細胞1h、3 h和6 h時，細胞mTOR磷酸化水平均顯著低于Ab-B株作用(1 h，t=3.90,P<0.05；3 h，t=4.56,P<0.05；6 h，t=2.93,P<0.05)。見圖5。

同一時間內，*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與Ab-B組比較

同一時間內，*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與Ab-B組比較

圖5 各組Raw 264.7細胞PI3K、Akt和mTOR蛋白磷酸化水平檢測

3 討論

多重耐藥和泛耐藥鮑曼不動桿菌是造成醫院內感染和呼吸機相關性肺炎的主要病原菌，但不同菌株的致病力差異顯著，目前尚無鮑曼不動桿菌毒力評估方法，無法為臨床治療提供支持[7]。莢膜是鮑曼不動桿菌的重要毒力因子，可以發揮保護細菌并抵抗宿主免疫細胞吞噬清除的功能。研究表明，細菌莢膜是重要的病原相關分子模式，可由宿主模式識別受體識別，并經過復雜途徑激活宿主免疫系統[8]。在上述過程中宿主為抵御病原體會產生大量活性氧，活性氧在炎癥損傷的發生和發展中發揮著重要作用。本研究結果表明，厚莢膜菌株(Ab-H株)誘導鼠巨噬細胞產生活性氧能力顯著高于薄莢膜菌株(Ab-B株)，其造成的炎癥損傷也更強。

現有的鮑曼不動桿菌莢膜研究集中于疫苗研制以及提高患者抗感染能力[9]，缺乏致病機制研究[10]。新生隱球菌外部厚重的莢膜不僅可以抵御外界不良環境，保護細菌自身不被宿主白細胞吞噬清除，還能夠直接活化宿主巨噬細胞向M1極化，分泌大量IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子，并引起巨噬細胞的“呼吸爆發”和大量活性氧生成，造成肺部細胞凋亡、自噬和壞死[11]。由此認為鮑曼不動桿菌莢膜也存在類似生物學功能。研究發現，鮑曼不動桿菌的感染能夠誘導Raw 264.7細胞自噬和凋亡，且細胞自噬和凋亡程度與細菌莢膜厚度呈正相關。自噬和凋亡都是細胞的兩種特殊死亡現象。自噬是細胞吞噬自身細胞質蛋白或細胞器并使其包被進入囊泡，與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物的過程，通過自噬可以實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新[12]。凋亡是細胞為維持內環境穩定，發生由基因控制的自主有序死亡。宿主巨噬細胞是固有免疫的重要組分，病原菌通過誘導宿主巨噬細胞的自噬和凋亡可以有效地降低宿主免疫力，有助于細菌在宿主體內存活[13]。本研究結果顯示，Ab-H株誘導Raw 264.7細胞自噬和凋亡能力顯著強于Ab-B株，表明厚莢膜菌可以誘導更多宿主巨噬細胞自噬和凋亡，減弱宿主免疫能力，有利于細菌的增殖。

活性氧是細胞自噬和凋亡重要的誘導劑，可以通過多條通路如atg4、過氧化氫酶和線粒體電子傳遞鏈引發細胞自噬和凋亡[14]。PI3K/Akt/mTOR信號通路是哺乳動物細胞重要生存通路之一，其中Akt分子作為PI3K/Akt/mTOR信號通路的關鍵分子，在促進細胞增殖、侵襲和轉移，抑制細胞自噬和凋亡中發揮核心作用。活性氧可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路激活[15]，促進各種炎癥因子的分泌，誘導細胞自噬和凋亡的發生[16]。本研究結果表明，兩株鮑曼不動桿菌均可以抑制Raw264.7細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活，而厚莢膜菌株抑制能力顯著強于薄莢膜菌株。

綜上所述，鮑曼不動桿菌莢膜是誘導宿主巨噬細胞自噬和凋亡的重要因子，其機制是通過誘導宿主巨噬細胞產生大量活性氧，抑制巨噬細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活，造成宿主巨噬細胞大量凋亡或自噬，致鮑曼不動桿菌逃避宿主免疫系統清除并大量增殖。并且，鮑曼不動桿菌誘導活性氧產生和巨噬細胞的凋亡或自噬以及抑制細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活，與其莢膜厚度呈正相關。