FLCN在子宮頸鱗癌組織中的表達及其對子宮頸鱗癌SiHa細胞增殖及凋亡的影響

張煜，楊佩芳，陳霞，欒曉瑾，顏一丹，于駿

(江蘇大學附屬醫院婦產科，江蘇 鎮江 212001)

FLCN基因于2002年從Birt-Hogg-Dube綜合征(Birt-Hogg-Dube syndrome，BHD)患者中克隆獲得，其定位于17號染色體短臂(17p11.2)[1]。FLCN結構和功能高度保守，在多種生命過程中都發揮重要作用[2]。目前研究發現，FLCN基因在遺傳性腎癌中發揮抑癌基因作用[3]。但是FLCN基因在子宮頸鱗癌中的致病機制仍不明確。本研究通過改變人子宮頸鱗癌SiHa細胞系中FLCN表達水平，探討FLCN與子宮頸鱗癌的關系，及其對SiHa細胞增殖與凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 選取2017年12月至2018年11月于江蘇大學附屬醫院婦科診治的27例子宮頸鱗癌患者(子宮頸鱗癌組)和27例因婦科良性腫瘤行全子宮切除術者(對照組)。其中，子宮頸鱗癌組平均年齡(53.72±9.63)歲，對照組平均年齡(48.48±7.45)歲。所有患者均未接受任何抗癌治療，標本均經病理證實。排除標準：鱗癌之外其他病理類型的子宮頸癌，合并內外科基礎疾病，伴有其他惡性腫瘤疾病及服用特殊藥物者，排除家族有遺傳性疾病、特別是遺傳性腎癌者。所有患者簽署知情同意書，并經本院倫理道德委員會同意。

1.1.2 標本處理 對照組和子宮頸鱗癌組宮頸組織標本離體后立即用0.9%生理鹽水沖洗去除血漬，剪成1～2 cm3，分成2份，其中1份于-80 ℃保存，用于實時熒光定量PCR(qRT-PCR)；另1份立即行甲醛固定，送至江蘇大學附屬醫院病理科，制成蠟塊，經4 μm連續切片后行免疫組化檢測。

1.1.3 主要試劑和儀器 子宮頸鱗癌SiHa細胞系(美國ATCC細胞庫)；Trizol試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；qRT-PCR引物序列、兔抗FLCN多克隆抗體(生工生物公司)；胎牛血清、DMEM、DPBS(南京福麥斯生物技術有限公司)；Opti-MEM(美國Gibco公司)；FLCN-eGFP(北京中原合聚經貿有限公司)；FLCN siRNA(吉瑪基因公司)；磷酸化組蛋白H3(PH3)一抗(美國Cell Signaling Technology公司)；cy3標記抗兔IgG(H+L)熒光二抗(美國Jackson公司)；CCK-8細胞增殖試劑盒及TUNEL凋亡細胞檢測試劑盒(諾唯贊公司)。

實時PCR儀(QuantStudio?5為美國Thermo公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 組織實驗

1.2.1 qRT-PCR檢測宮頸組織FLCN mRNA表達 將收集的組織標本移至用液氮預冷的研缽中，研磨勻漿，加入Trizol試劑提取組織總RNA，反轉錄為cDNA。qRT-PCR總反應體系10 μL，包括SYBR Premix ExTaqⅡ 5 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA模板0.4 μL，其余部分用滅菌雙蒸水補充。循環參數：預變性95 ℃ 2 min，PCR擴增95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 60 s，共40個循環。以GAPDH作為內參，采用2-ΔΔCt方法計算目的基因相對表達水平。引物序列如下，FLCN上游引物：5′-CCTCCTCTCTCTCAGGCTGT-3′，下游引物：5′-TGTATGGGATGATGCGGACG-3′；GAPDH上游引物：5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGC-3′，下游引物：5′-TTCAGCTCAGGGATGACCTT-3′。實驗重復3次。

1.2.2 免疫組化SP法檢測子宮頸組織中FLCN蛋白表達 蠟塊標本經4 μm連續切片，烘片機中烘片30 min，常規脫蠟水化、抗原修復、去除內源性過氧化物酶、血清封閉處理。加兔抗人FLCN 抗體(1 ∶200)，PBS代替一抗作為陰性對照，4 ℃孵育過夜；羊抗兔IgG(1 ∶200)室溫孵育30 min；PBS洗3次，DAB顯色及蘇木精復染。乙醇脫水干燥，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍片。

FLCN表達主要位于細胞核及細胞質，陽性表達呈棕黃色或棕褐色顆粒，陰性對照組中無著色。參考文獻[4-5]免疫組化評分標準，根據著色細胞百分比及細胞著色深淺分別計分判定結果：陽性細胞百分比<10%為0分，10%～29%為1分，30%～49%為2分，≥50%為3分；細胞著色深淺：不著色為0分，淺棕色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分。兩項得分相乘即為綜合評分。

1.3 細胞實驗

1.3.1 細胞培養 SiHa細胞采用含10%胎牛血清、青霉素(100 μg/mL)、鏈霉素(100 μg/mL)的DMEM，在37 ℃、含有5%CO2培養箱內進行孵育，細胞呈貼壁生長。隔天換培養基，每2 d或待細胞密度達到70%以上傳代，取對數生長期的細胞進行后續實驗。

1.3.2 RNA干擾 細胞分為陰性對照組(轉染陰性對照siRNA)和實驗組(轉染FLCN siRNA-630)。轉染前將SiHa細胞按1.5×105個/mL接種于6孔板，待細胞生長至匯合度達80%左右進行轉染，操作按脂質體LipofectamineTM2000試劑說明書進行。siRNA序列如下，陰性對照 siRNA：正義鏈5′-ΜΜCΜCCGAACGΜGΜCACGΜTT-3′，反義鏈5′-ACGΜGACACGΜΜCGGAGAATT-3′；FLCN siRNA-630：正義鏈5′-GGGUGAGCAGGCGGAAGAATT′，反義鏈5′-UUCUUCCCGCCUGCUCACCCTT-3′。

1.3.3 瞬時轉染 細胞分為空白對照組(轉染空白質粒)和實驗組(轉染FLCN-eGFP質粒)操作同“1.3.2”。轉染6 h后換為完全培養基，48 h后行qRT-PCR。

1.3.4 qRT-PCR檢測SiHa細胞FLCN mRNA表達量 棄上述對照組及實驗組SiHa細胞培養液，PBS清洗1次，每10 cm2加入1～2 mL Trizol試劑，移液器反復吹吸直至裂解液中無明顯沉淀，提取組織總RNA后反轉錄為cDNA。qRT-PCR總反應體系及操作引物序列同“1.2.1”。

1.3.5 免疫熒光檢測PH3蛋白表達 將上述對照組及實驗組SiHa細胞轉染24 h后，轉種于放置有圓形玻片的24孔板內，繼續培養24 h后進行免疫熒光實驗。4%低聚甲醛固定20 min；含0.1% TritonX-100的PBS清洗3次，每次10 min；5%牛血清白蛋白封閉30 min；加入PH3一抗室溫孵育1 h；含0.1% TritonX-100的PBS清洗3遍；cy3標記抗兔IgG(H+L)熒光二抗室溫孵育1 h；含0.1% TritonX-100的PBS清洗，去除多余二抗；加入100 μL 1.0 mg/mL的Hoechst33342染DNA 15 min；防熒光淬滅劑封片；用熒光顯微鏡采集SiHa細胞免疫熒光圖片，每幅圖像取3個不同視野，并根據陽性細胞率進行分析。

1.3.6 CCK8檢測細胞增殖 將上述對照組及實驗組轉染后SiHa細胞用不含EDTA的胰酶消化；接種于96孔板，每孔細胞數為2.5×103個；分別于轉染后0 h、6 h、24 h、48 h加入10 μL CCK-8溶液，于孵箱內避光孵育1 h；酶標儀測定450 nm處光密度值，間接反映活細胞數量，每個樣本做3個復孔。

1.3.7 TUNEL法檢測細胞凋亡 將轉染24 h后上述對照組及實驗組SiHa細胞，接種于放置有圓形玻片的24孔板內，繼續培養24 h后進行TUNEL檢測。根據試劑盒操作說明進行試驗，熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡數并拍照。用ImageJ記錄凋亡細胞數，對結果進行統計分析。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 宮頸組織中FLCN mRNA和蛋白表達

子宮頸鱗癌組宮頸組織中FLCN mRNA表達明顯低于對照組(t=4.49，P<0.05)。免疫組化結果顯示，對照組宮頸組織中FLCN蛋白主要表達于細胞核及細胞質，表達強度較強；而子宮頸鱗癌組宮頸組織中FLCN蛋白主要表達于細胞質和細胞膜，表達強度較弱，見圖1。兩組間FLCN蛋白表達水平比較，FLCN在子宮頸鱗癌組中表達明顯低于對照組，差異有統計學意義(Z=7.04，P<0.01)。

圖1 FLCN mRNA和蛋白在兩組子宮頸組織中的表達

2.2 RNA干擾或轉染質粒后SiHa細胞中FLCN mRNA相對表達量

siRNA干擾后，SiHa細胞內FLCN mRNA表達量相對于對照組降低約70%(t=6.64，P<0.05)；qRT-PCR結果顯示，轉染FLCN-eGFP質粒48 h后，FLCN mRNA表達較空白對照組顯著升高(t=9.34，P<0.05)，見圖2。

圖2 SiHa細胞中FLCN mRNA相對表達水平

2.3 FLCN siRNA促進SiHa細胞增殖，抑制SiHa細胞凋亡

與對照組相比，FLCN siRNA-630組中PH3蛋白陽性細胞數增多(t=4.47，P<0.05)。CCK-8檢測結果顯示，與對照組相比，FLCN siRNA-630組細胞450 nm處光密度值在6 h、24 h及48 h 均明顯高于對照組(P均<0.01)，見圖3，由此表明，細胞增殖能力增強。與對照組相比，FLCN siRNA-630組TUNEL陽性細胞數明顯減少(t=5.21，P<0.05)，見圖4。

2.4 FLCN過表達抑制SiHa細胞增殖，促進SiHa細胞凋亡

與對照組相比，FLCN過表達組中PH3蛋白陽性細胞數明顯減少(t=12.35，P<0.01)。CCK8檢測結果顯示，與對照組相比，FLCN過表達組細胞450 nm處吸光度值在6 h、24 h及48 h均明顯低于對照組(P<0.05或<0.01)，見圖5，表明細胞增殖能力減弱。與對照組相比，FLCN過表達組TUNEL陽性細胞數明顯增多(t=59.55，P<0.01)，見圖6。

a:P<0.05，與同時間點陰性對照組比較

圖4 轉染FLCN siRNA-630后對SiHa細胞凋亡的影響

3 討論

FLCN基因是目前已知的唯一同時與各類腎細胞癌有關的基因[6]。FLCN除了與遺傳性腎癌密切相關外，還與結腸腫瘤[7]、嗜酸性腮腺瘤[8]和甲狀腺腫瘤[9]等相關。本研究結果顯示，在子宮頸鱗癌組織中，FLCN mRNA及蛋白表達水平均低于正常宮頸組織，表明FLCN參與子宮頸癌的發展。

腫瘤細胞增殖和凋亡由細胞內外多個信號通路共同參與完成，其調控機制失常是導致腫瘤發生和發展的重要因素之一[10]。Hasumi等[11]研究發現，在小鼠腎臟細胞中，干擾FLCN蛋白表達可促進細胞增殖。本研究結果顯示，下調SiHa細胞中FLCN mRNA表達，PH3蛋白陽性細胞數增加；反之上調FLCN mRNA表達，PH3蛋白陽性細胞數減少，由此提示FLCN可抑制SiHa細胞增殖。凋亡是細胞正常程序性死亡過程，是調節機體細胞數量的一種生理機制，凋亡失衡是導致癌癥發生的重要原因，而癌細胞的過度增殖對腫瘤的發展與惡化有促進作用[12]。本研究結果顯示，下調SiHa細胞中FLCN mRNA表達，TUNEL蛋白陽性細胞數減少；反之上調FLCN mRNA表達，TUNEL蛋白陽性細胞數增加，由此提示FLCN可促進SiHa細胞凋亡；這與Piao等[13]針對小鼠肺泡上皮細胞研究結果一致。

a:P<0.05，b:P<0.01，與同時間點空白對照組比較

圖6 轉染FLCN質粒后對SiHa細胞凋亡的影響

綜上所述，FLCN基因可抑制SiHa細胞增殖，促進細胞凋亡，說明FLCN是子宮頸鱗癌的抑癌基因。但本研究僅從體外實驗研究細胞的增殖及凋亡，有一定的局限性，且其內在的具體分子機制尚不明確，還需要更多的研究來闡述。