微小RNA在自身免疫性甲狀腺疾病中的研究進展

丁祥梅，彭輝勇，柳迎昭

(江蘇大學附屬人民醫院 1.內分泌科，2.檢驗科，江蘇 鎮江 212002)

自身免疫性甲狀腺疾病(autoimmune thyroid disease, AITD)是免疫介導的一組器官特異性自身免疫疾病，其中Graves病(Graves′ disease, GD)和橋本甲狀腺炎(Hashimoto′s thyroiditis, HT)為兩種主要的臨床分型[1]。盡管GD的主要臨床表現是甲狀腺亢進而HT主要表現為甲狀腺功能減退，但兩者均以甲狀腺淋巴細胞浸潤和甲狀腺自身抗體的產生為特征，可能與特定易感基因、環境暴露的復雜以及多因素相互作用有關，導致自身耐受性受到破壞和而后自身免疫性疾病的發展[1-3]。

近年來多項研究[3-5]表明，微小RNA(miRNA)參與腫瘤、自身免疫性疾病等多種疾病的發病。本文將綜述miRNA在AITD中的研究新進展。

1 miRNA簡介

miRNA是一類內源性非編碼小RNA分子，由18～25個核苷酸組成，參與調控人類近1/3的基因，因此在大多數生理和病理過程中起著至關重要的作用，包括細胞生長和分化，新陳代謝，癌癥以及自身免疫等[2-5]。miRNA通過與其對應的靶基因結合從而沉默或降解目標mRNA，轉錄后水平負性調節基因表達，但是，miRNA對靶基因的調控受多種因素影響，包括與靶基因結合位點及其作用方式、Dicer 酶剪切位點等[5]。研究發現一種miRNA能夠調控數個甚至數百個靶基因，而一些基因也會被數個miRNA同時調控[5-6]。近年來多項研究[3-4]發現，miRNA調控多種機體生物學功能，如細胞增殖、分化，細胞凋亡，炎癥和免疫反應等。

2 miRNA與免疫細胞

免疫細胞主要在機體抵抗病原體感染、清除突變細胞及維持免疫穩態中發揮作用，其中包含淋巴細胞、樹突狀細胞(dendritic cells, DC)、中性粒細胞、自然殺傷細胞等。大量研究[5-7]發現，miRNA參與各類免疫細胞的增殖、分化及活化等一系列過程。

2.1 miRNA與Th細胞

CD4+T細胞是T淋巴細胞的主要亞群，其在抗原和共刺激信號作用下分化成不同類型T細胞，包括輔助性T細胞(T helper cell, Th)和調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)，前者如Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞等；這些Th細胞亞群能夠分泌各種不同的細胞因子，進而參與細胞和體液免疫應答[7-8]。

胰島素受體底物(insulin receptor substrate-1, IRS-1)是IRS家族成員之一，作為胞內重要的信號轉導中間體，IRS-1主要功能是連接細胞表面激活受體傳遞的跨膜信號和下游效應器，該信號蛋白與ERK、AKT及NF-κB信號傳導途徑密切相關[9]。早期研究[10-11]發現，IRS-1與代謝性疾病的發生和腫瘤產生緊密相關。近來研究發現，IRS-1在T細胞活化中發揮重要作用[12]。miR-126位于EGFL7內含子內，在血管、心臟、肺的內皮細胞中高表達。Chu等[13]發現，miR-126敲除小鼠CD4+T細胞的活化、增殖及干擾素γ水平均顯著高于野生型小鼠，進一步研究發現miR-126的靶基因IRS-1在miR-126缺陷的CD4+T細胞中表達上調，同時伴有ERK，AKT和NF-κB信號途徑的轉導改變。由此可見，敲除miR-126后IRS-1信號通路激活促進CD4+T細胞活化，同時促進向Th1細胞分化。

Th1細胞主要產生IFN-γ，介導細胞免疫應答，其主要轉錄因子是T細胞中表達T盒轉錄因子(T-box expressed in T cell,T-bet)。miR-92a屬于miR-17-92簇，也稱為oncomiR-1，miR-17-92簇是位于13號染色體(13q31-Q32)長臂C13orf25基因座的第三內含子中的miRNA簇，其在自身免疫疾病患者體內異常表達[14]。Rezaei等[15]在自身免疫性腦脊髓炎模型小鼠的研究中發現，miR-92通過靶向調節TSC1或DUSP10表達促進Th1細胞分化(圖1)。促炎型Th1細胞大量存在于炎癥組織中，參與風濕性疾病中慢性炎癥反應；Bardua等[16]研究發現，miR-31通過TCR-趨化因子受體-整合素信號傳導在下游的肌動蛋白細胞骨架重排中調控基因表達，從而降低促炎性Th1細胞的運動性；抑制miR-31表達可增加反復活化的Th1細胞的遷移活性。此外，T-bet和FOXO1分別為T細胞受體介導的miR-31表達的正調節劑和負調節劑[17]，三者構成促炎性Th1細胞遷移的調控網絡(圖1)。

Th17細胞是一群分泌IL-17的T細胞亞群，其在誘導炎癥反應和自身免疫性疾病中發揮一定作用，Th17細胞的經典調控途徑為IL-6/轉化生長因子β(transforming growth factorβ, TGF-β)/視黃酸相關孤獨核受體(retinoid-related orphan receptor gammat, RORγt)途徑，此外還有IL-21/TGF-β/RORγt途徑和IL-23/IL-22擴增途徑等[14]。多項研究[18-21]表明，miR-326負向調控Ets-1進而促進Th17細胞分化，繼而參與系統性紅斑狼瘡、多發性硬化等自身免疫性疾病的發生。Zhao等[20]在碘致甲狀腺炎的小鼠模型中發現，miR-326抑制Ets-1表達并促進Th17細胞分化，同時miR-326抑制劑能夠促進Th17細胞產生和Ets-1蛋白表達(圖1)。miR-146a是免疫調節中的重要調控因子，多項研究[22-26]表明其參與多種自身免疫性疾病。miR-146a可以通過靶向調節TRAF 6、IRAK 1和STAT 1等間接調控一系列信號通路，共同阻止CD4+T細胞產生促炎性Th1和Th17反應，并誘導T細胞介導自身免疫[24-25]。Li等[26]研究發現，miR-146可以阻斷自分泌的IL-6和IL-21誘導的自身反應性CD4+T細胞的Th17分化途徑，從而參與自身免疫病的發生發展。Wu等[27]研究發現，miR-10a在炎癥性腸病炎癥黏膜中表達降低，其機制是抑制IL-12/IL-23p40和NOD2表達，從而阻斷Th1/Th17細胞的免疫反應，進而降低炎癥反應。

2.2 miRNA與Treg細胞

CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞在維持機體對自身抗原的免疫應答和抑制，以及宿主的過度免疫應答中發揮著重要的作用，其細胞功能主要依賴于叉頭樣螺旋轉錄因子的表達，分泌TGF-β、IL-10、IL-35等免疫性細胞因子，參與免疫耐受機制的建立。有研究發現[28]，多種自身免疫性疾病與效應T細胞的功能失調有關。在功能上，Th1和Th2細胞在轉錄因子水平上互相抑制，Th17和Treg細胞類似地相互制約[29]。Treg細胞對AITD起保護作用，Treg細胞耗竭可促進實驗性自身免疫性甲狀腺炎的發生，在多個AITD患者和甲狀腺炎動物模型研究[30-32]中，檢測到Treg細胞數目減少和(或)功能缺陷。miR-210可通過與Foxp3的3′-UTR區域結合，抑制Foxp3核酸和蛋白表達，繼而減弱Treg免疫抑制功能[33](圖1)。Hiratsuka等[34]報道，與健康對照組相比，GD患者中miR-210水平增加約3倍。Zheng等[23]發現，GD患者血清miR-210水平較高，其與甲狀腺大小呈正相關，與Foxp3表達呈負相關，同時GD患者中Foxp3表達較健康對照組降低。由此表明，GD患者體內miR-210水平增高可能通過靶向抑制Foxp3表達，繼而削弱Treg細胞功能，從而參與GD發生發展。

2.3 miRNA與DC

DC是機體最重要的抗原提呈細胞，參與T細胞免疫應答。Hoye等[35]在自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型中發現，miR-31可直接抑制IL-34表達，而IL-34是小膠質細胞存活以及維持血腦屏障完整性的關鍵組成部分，同時發現miR-31在通過血腦屏障的骨髓來源的DC中異常表達，表明在炎癥過程中，miR-31可能起著調節DC通過血腦屏障轉運的作用。由此說明，在自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型中，miR-31可能通過調節DC進入中樞神經系統從而參與多發性硬化等中樞神經系統自身免疫性疾病的發病。Huang等[36]研究發現，miR-34a過表達的小鼠體內常規DC和漿細胞樣DC增加，進一步探索發現miR-34a可促進漿細胞樣DC分化為常規DC和漿細胞樣DC，而不影響DC的增殖和凋亡；同時發現miR-34a過表達的DC中TCF1表達量顯著下調及RORγt表達量上調，而WNT/β-catenin/TCF1通路調節中樞和外周免疫系統中的T細胞功能。上述發現表明，miR-34a/WNT/TCF1通路可能參與DC細胞對T細胞的分化調控。

圖1 免疫細胞中miRNA調節

在miRNA的免疫機制研究中，不僅可以關注miRNA在免疫細胞中信號通路，也可以把某些miRNA作為疾病的檢測指標。

3 miRNA與AITD

AITD 是一種常見的自身免疫性疾病，主要包括GD和HT兩種疾病。近年來，大量研究[37-39]發現，miRNA在AITD患者異常表達(表1)，在AITD的發生發展中發揮作用。

表1 AITD中miRNA的異常表達[37-44]

注：↑表示miRNA在AITD中相對于健康對照組上調，↓表示miRNA在AITD中相對于健康對照組下調

3.1 miRNA異常表達在GD發病中的作用

GD是AITD中最常見的一種疾病，以彌漫性甲狀腺腫和甲亢為特征。GD患者體內miRNA變化可能在GD的發病機制中起作用。Chen等[37]對未經治療GD患者研究發現，GD患者甲狀腺組織、外周血單個核細胞、血清中let-7b相對表達水平較健康對照組相比顯著上調，同時發現let-7b與GD的臨床指標促甲狀腺激素受體抗體水平呈高度相關，進一步研究發現，let-7b可能靶向調控PLZF，而PLZF是屬于BTB/POZ家族的轉錄因子，通過將多蛋白復合物募集到調節基因元件而發揮作用,從而阻止促甲狀腺激素受體的產生，進而影響促甲狀腺激素受體抗體的產生，參與GD發生發展。

Chen等[38]通過對23例GD患者，其中11例為緩解期GD患者，24例為健康對照者的血清進行研究分析，發現miR-346表達在GD患者中下調，其靶基因Bcl-6恰好相反，同時miR-346過表達致CD4+CXCR 5+T細胞功能減弱。GD患者血清miR-346水平與CD4+CXCR5+T細胞百分率呈負相關[39]。此外，GD患者外周血CD4+T細胞中miR-346表達水平與血清中促甲狀腺素受體抗體、抗甲狀腺過氧化物酶抗體、抗甲狀腺球蛋白抗體等水平呈負相關。miR-346通過抑制濾泡輔助T細胞的陽性調節因子Bcl-6進而調控CD4+CXCR5+T細胞(圖2)，從而參與GD的發病過程。

Yamada等[40]發現GD患者血清miR-16水平顯著高于健康受試者。Caselli等[41]發現，在通過HHV-6 A誘導AITD期間，HHA-6V感染的T淋巴細胞誘導miR-16顯著增加。上述研究表明miR-16可能在AITD發病機制中起重要作用，但具體機制尚需進一步研究。

Qi等[42]在GD患者的CD4+T細胞中發現miR-4443直接抑制TRAF4表達，進而通過NF-κB途徑誘導CD4+T細胞因子異常分泌和增殖。TRAF4是TRAF超家族的成員之一，與其他成員不同，其可以負調節免疫信號傳導，其與NOD2、TRAF6以及TRIF相互作用以抑制NF-κB活化；同時發現，初發GD患者中的miR-4443異常表達與FT3、FT4、TRAB呈高度相關[42]，由此可見，miR-4443可能通過負向調控TRAF4從而參與GD的發病過程。

3.2 miRNA異常表達在HT發病中的作用

HT是AITD中另一種較常見的疾病。Zhao等[6]通過對100例HT患者及健康對照組進行檢測發現，HT患者外周血中miR-205，miR-20a-3p,miR-375,miR-296,miR-451和miR-500a 6種miRNA表達水平明顯高于健康者；其中miR-451，miR-375和miR-500 a 3種miRNA與促甲狀腺激素水平相關，而miR-20a-3p與甲狀腺球蛋白抗體(Thyroglobulin antibody，TgAb)水平相關；miR-451異位表達可能通過caspase-3依賴的方式降低細胞活力，促進細胞凋亡，也參與HT患者體內細胞凋亡的外部途徑；同時發現血漿中miR-375和miR-500a高表達與TSH水平呈負相關，miR-20a-3p與TgAb水平呈負相關[6]。miR-375，miR-500a，miR-20a-3p在HT患者中的作用機制尚不明確，尚需進一步對miRNA靶基因及功能分析。

miR-142是造血特異性分子之一，在造血細胞分化成熟中發揮重要作用，其有miR-142-5p和miR-142-3p兩種成熟形式，其中miR-142-5p主要存在于Treg細胞，在多種自身免疫性疾病進展中發揮著一定的作用[42]。Zhu等[44]通過對20例HT患者甲狀腺組織標本中的miRNA進行篩選發現，miR-142-5p，miR-142-3p和miR-146均高表達，結合HT患者臨床數據分析發現miR-142-5p與TgAb呈正相關；同時對HT患者的血清和濾泡上皮細胞行定量PCR分析發現，miR-142-5p相對表達量較健康者顯著升高，并證實其可直接與CLDN1非編碼序列結合位點結合，從而抑制CLDN1表達。CLDN1作為一種膜蛋白，屬于claudin家族，是緊密連接的組成部分，可充當物理屏障，防止溶質自由通過旁細胞間隙[45]。miR-142-5p可能通過抑制CLDN1表達從而破壞細胞旁屏障，使自身抗原如TPO、TG等被免疫系統識別[42]。因此，miR-142-5p可能通過CLDN1參與HT的發生。

Peng等[46]發現，HT患者外周血中miRNA-125a-3p相對表達量較健康者明顯降低，同時IL-23R mRNA水平升高，且與TgAb水平呈負相關；進一步研究發現，miR-125a-3p與IL-23受體3′-UTR結合從而抑制IL-23受體表達(圖2)。IL-23對維持Thl7細胞的存活和增殖起重要作用，其主要通過IL-23受體發揮對細胞的調控作用[47]，可見IL-23受體對Thl7細胞的調節發揮關鍵作用。上述結果提示miR-125a-3p可能通過影響IL-23受體表達調控Th17細胞功能，從而參與HT的發生發展。

Tfh細胞：濾泡輔助T細胞

4 展望

綜上所述，miRNA通過各種調控通路影響免疫細胞增殖、分化以及凋亡，同時miRNA還可以通過調控不同的信號通路來影響免疫細胞的數量和功能，參與自身免疫性疾病的發病，未來可通過對miRNA靶基因的鑒定和功能分析，分析免疫細胞的過度免疫和免疫功能缺損的分子機制，解釋自身免疫性疾病的發病機制。