鰱魚骨膠原多肽的制備及其抗氧化活性研究

李軍，羅娟，涂宗財,3*，張露

1(江西師范大學， 國家淡水魚加工技術研發專業中心，江西 南昌，330022)2(江西師范大學 江西省淡水魚高值化利用工程技術研究中心，江西 南昌，330022)3(南昌大學， 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌，330047)

鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)俗稱為白鰱、水鰱等[1]，具有生長迅速、產量高、營養價值高等特點，在2017年我國淡水養殖魚類產量中位居第二，達到385.28萬t[2-3]。在鰱魚的加工過程中，產生大量的魚骨、魚皮、魚鱗等副產物。其中，魚骨中含有豐富的蛋白、不飽和脂肪酸、鈣、磷等營養成分，是一種優良的營養食物資源[4]。

近年來，利用魚骨制備膠原多肽尤其是抗氧化肽成為了研究熱點[5-10]。相比陸生動物來源的膠原多肽而言，水產動物來源的膠原多肽沒有瘋牛病、豬瘟、禽流感等動物疾病的威脅[11]；同時與市場上常見二丁基羥基甲苯、丁基羥基茴香醚等存在致癌風險的抗氧化劑相比[12]，水產動物來源的天然抗氧化肽對人體更加安全、有效，其在食品、化妝品和醫療等領域中具有廣闊的應用前景。

目前，以鰱魚骨為原料制備高抗氧化活性的膠原多肽的研究鮮有報道。本文以鰱魚骨為原材料，采用單因素實驗、響應面優化實驗確定鰱魚骨膠原多肽的最佳制備工藝，然后采用Sephadex G-25凝膠色譜對制備得到的膠原多肽進行分離純化，得到高抗氧化活性的多肽組分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鰱魚骨，由丹江口市優優水產開發有限公司提供。

中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；復合蛋白酶，江蘇銳陽生物科技有限公司；細胞色素C、抑肽酶、羥脯氨酸(色譜純)，北京索萊寶科技有限公司；L-氧化型谷胱甘肽、三氟乙酸(色譜純)，上海阿拉丁生化科技有限公司； 2,2′-聯氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS)(分析純)，北京索萊寶科技有限公司；三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)、K3[Fe(CN)6]、FeCl3(分析純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

電子分析天平(FA1104N型)，上海丙林電子科技有限公司；SevenCompact臺式pH計(S220)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；數顯恒溫水浴鍋(HH-6型)，國華電器有限公司；自動凱氏定氮儀(SKD-800型)，上海沛歐分析儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS-100SII)，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；實驗噴霧干燥塔(MDR-5型)，無錫市現代噴霧干燥設備有限公司；冷凍干燥機(SR-AON-50)，上海舍巖儀器有限公司；紫外可見分光光度計(U-2910型)，Hitachi High-Tech Science Corporation；HSM高效液相色譜(D-2000)，日本Hitachi公司；氨基酸分析儀(L-8900)，日本Hitachi公司；紫外檢測儀(HD-21-88)，上海琪特分析儀器有限公司；全自動部分收集器(BSZ-160)，上海青浦滬西儀器廠；精密蠕動泵(BT100-2J)，保定蘭格恒流泵有限公司；酶標儀(Synergy H1)，美國Bio Tek公司。

1.3 方法

1.3.1 鰱魚骨預處理

鰱魚骨粉制備工藝：

鰱魚骨→解凍→沸水煮5 min→剔除魚肉和膜性組織→沖洗→高壓蒸煮(124 ℃、1.5 h)[4]→去上層脂肪→膠體磨→噴霧干燥→鰱魚骨粉

1.3.2 酶解提取工藝

膠原多肽提取工藝：

鰱魚骨粉→按一定料液比加水→調節pH→加酶→水浴酶解→滅酶(100 ℃，10 min)→離心→膠原多肽溶液→凍干→膠原多肽粉末

1.3.3 蛋白酶的篩選

分別選用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶和復合蛋白酶對魚骨粉進行水解，其酶解條件如表1所示[13-14]。以膠原多肽得率結合水解度為指標，篩選出合適的蛋白酶。

表1 5種蛋白酶的酶解條件

注：5種蛋白酶酶活力參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》中福林酚法測定[15]。

1.3.4 魚骨膠原多肽提取工藝優化

1.3.4.1 單因素試驗設計

采用復合蛋白酶水解魚骨粉制備膠原多肽，以膠原多肽得率結合水解度為指標進行單因素試驗設計。分別固定其他因素，依次評價料液比(1∶20、1∶15、1∶10、1∶8、1∶6、1∶4，g∶mL)、酶添加量(2 000、4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g)、pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)、酶解溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)、酶解時間(1、2、3、4、5、6 h)對魚骨粉酶解效果的影響。

1.3.4.2 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以膠原多肽得率為響應值(Y)，選取酶添加量(A)、酶解溫度(B)、酶解時間(C)對魚骨粉酶解影響較強的3個因素為自變量，利用Box-Behnken中心組合原理設計3因素3水平的響應面試驗，探索從魚骨中制備膠原多肽的最佳條件。

1.3.5 評價指標的測定

1.3.5.1 膠原多肽得率的測定

參照賈瑞波等[16]的方法略作修改，采用Folin-酚法測定酶解液中膠原多肽的含量。以質量濃度為 0～200 μg/mL的牛血清白蛋白為橫坐標(X)，650 nm處的吸光值為縱坐標(Y)，繪制牛血清白蛋白的標準曲線：Y=0.001 6X-0.005 8(R2=0.998 5)。取1 mL稀釋到適宜濃度的酶解液進行測定，其結果代入標準曲線計算酶解液中膠原多肽的含量。參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法進行測定原料中總蛋白含量[17]。按公式(1)計算酶解液中膠原多肽得率：

(1)

1.3.5.2 水解度的測定

采用甲醛滴定法[18]測定酶解液中游離氨基氮含量，參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法進行測定原料中總氮含量[17]。按公式(2)計算酶解液的水解度：

(2)

1.3.6 酶解液中膠原多肽分子質量分布的測定

按照GB 31645—2018《食品安全國家標準 膠原蛋白肽》中高效體積排阻色譜法(high performance size exclusion chromatography，HPSEC)進行測定酶解液中膠原多肽分子質量的分布情況[19]。按照上述最優條件制備魚骨膠原多肽溶液，離心取上清液凍干，配制成2 mg/mL的溶液，過0.22 μm水系濾膜后，使用高效液相色譜儀(high performance liquid chromatograph，HPLC)上樣分析。以質量濃度為2 mg/mL的細胞色素C(12 384 Da)、抑肽酶(6 511.51 Da)、L-氧化型谷胱甘肽(612.63 Da)和羥脯氨酸(131.13 Da)為標準品繪制相對分子質量校正曲線。色譜柱：XBridge BEH 125? SEC(3.5 μm，(7.8×300) mm)；流動相：V(乙腈)∶V(水0.1%TFA)=40∶60；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

1.3.7 Sephadex G-25分子篩層析

填料預處理：稱量30 g Sephadex G-25干凝膠于300 mL燒杯中，加入適量的超純水并攪拌，于室溫下浸泡24 h后使其充分溶脹。

裝柱：選取規格16 mm×80 cm的層析柱，超純水洗凈后固定在鐵架臺上。出口接上乳膠管，先往層析柱內加入少量的超純水，將預先準備好的Sephadex G-25填料混勻，緩慢倒入層析柱至液面高度為2～3 cm。連接進水口并打開恒流泵，用超純水進行平衡至液面高度不再發生改變。

上樣：將凍干的膠原多肽粉末用超純水配制成濃度為100 mg/mL，過0.22 μm水系濾膜后取2 mL上樣。

洗脫收集：洗脫液：超純水；流速：0.4 mL/min；紫外檢測波長：220 nm；每管收集量：4 mL。將同一組分合并收集，凍干并稱其質量。

1.3.8 不同分子質量多肽氨基酸組成分析

參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》[20]，采用氨基酸分析儀對樣品中氨基酸的含量進行測定。

1.3.9 體外抗氧化活性的測定

1.3.9.1 ABTS+·清除能力的測定

采用KETNAWA等[21]方法以ABTS+·清除能力實驗評價不同分子質量多肽的抗氧化能力：稱取38.4 mg ABTS和6.623 mg過硫酸鉀混合，蒸餾水溶解后并定容至10 mL配成ABTS+·母液。室溫避光反應12～16 h后用0.2 mol/L，pH 7.4的磷酸緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)稀釋ABTS+·母液至在734 nm處的吸光值為0.7±0.2左右。分別移取50 μL稀釋到適宜濃度的樣品溶液與150 μL ABTS+·溶液于96孔酶標板上混勻，室溫下避光反應6 min后于734 nm處測定吸光值(Ai)。以50 μL蒸餾水代替樣品的反應體系為控制組(Ac)，以150 μL PBS代替ABTS+·溶液的反應體系為樣品空白組(Aj)，以50 μL蒸餾水和150 μL PBS分別代替樣品和ABTS+·溶液的反應體系為空白組(Ab)。以谷胱甘肽(glutathione，GSH)為陽性對照，結果用百分抑制率表示，采用Origin 8.6軟件中的多項擬合計算樣品清除50%的自由基所需樣品的濃度。按公式(3)計算ABTS+·清除能力：

(3)

1.3.9.2 還原能力的測定

采用賈韶千等[22]方法測定不同分子質量多肽之間的還原能力。分別移取0.2 mL不同濃度的樣品溶液與0.5 mL 1 % K3[Fe(CN)6]混合，50 ℃水浴20 min后，加入0.5 mL 10% TCA終止反應。將反應液以5 000 r/min離心5 min，取上清液0.5 mL于離心管中，分別加入0.5 mL蒸餾水和0.2 mL 0.1 % FeCl3，搖勻后置于50 ℃水浴10 min。取200 μL溶液于700 nm處測定吸光值。0.2 mL蒸餾水代替FeCl3作為空白對照。以GSH為陽性對照，OD1.0值表示使反應體系的吸光值為1.0時所需要的樣品濃度。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 最優酶的篩選

在蛋白酶的作用下，魚骨中的膠原蛋白會進行水解形成膠原多肽，過度水解則會進一步將膠原多肽水解成小分子質量的短肽和游離氨基酸，導致膠原多肽含量的降低[23]。5 種不同蛋白酶對鰱魚骨的酶解效果如圖1所示。其中，風味蛋白酶的水解度最高，然后依次是復合蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶。經復合蛋白酶酶解之后，酶解液中膠原多肽得率最高，達到43.72 %(P<0.05)，風味蛋白酶與復合蛋白酶相比，其膠原多肽含量低，是由于水解度高，比其他酶水解更加徹底，由于部分膠原多肽水解形成氨基酸所致。而堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶水解鰱魚骨中膠原蛋白的能力弱于復合蛋白酶，水解度較低，故膠原多肽含量低于復合蛋白酶。由此可見，在酶活力和酶解時間相同的情況下，復合蛋白酶酶解鰱魚骨制備膠原多肽的效率最高。本次實驗使用的復合蛋白酶是由多種酶混合復配而成，主要以堿性蛋白酶和風味蛋白酶為主，其主要作用位點是疏水氨基酸[24]，與其他蛋白酶相比，可以獲得更多的抗氧化肽。經酶活力測定，復合蛋白酶的酶活力高于堿性蛋白酶(單酶)，且風味蛋白酶的存在又可以降低苦味肽的形成[25]，適用于骨、肉副產物的水解和骨膠原多肽的生產。為了更好地制備高抗氧化活性膠原多肽，節約成本，綜合考慮選擇復合蛋白酶用于后續魚骨膠原多肽制備工藝的優化。

圖1 5種蛋白酶的酶解效果

2.2 單因素試驗結果

復合蛋白酶酶解鰱魚骨制備膠原多肽的單因素試驗結果如圖2-a～圖2-e所示。由圖2-a可知，膠原多肽得率隨料液比的增大呈下降的趨勢，水解度先上升后趨于平穩，在料液比為1∶10(g∶mL)時，其膠原多肽含量和水解度都較高，當料液比繼續增大，膠原多肽得率反而下降。由圖2-b可知，膠原多肽得率和水解度隨著酶添加量的增加而呈現先上升后下降的趨勢，當酶添加量為8 000 U/g時，膠原多肽得率最高，達49.00 %(P<0.05)，繼續增大酶添加量，膠原多肽得率反而下降。由圖2-c可知，膠原多肽得率和水解度隨著pH的增加而呈現先上升后下降的趨勢，當pH為8.0時，膠原多肽得率最高，達44.38 %(P<0.05)。圖2-a～圖2-c的結果與劉靜[26]的報道相一致，原因在于底物濃度隨著料液比的增大而增大，但一定量的酶無法酶解過多的底物，導致膠原多肽增加的比例小于底物增加的比例，這也是底物濃度越大其膠原多肽得率越小的主要原因；在適宜溫度的條件下，復合蛋白酶含量增加，使底物和蛋白酶更加充分反應，水解度和膠原多肽得率增大，當酶量增加到一定量的時候，酶和底物結合位點達到飽和，此時再增加酶量也不會促進底物的水解，反而造成酶的浪費；pH過低或過高都會影響復合蛋白酶的活性，進而影響酶解效果。

由圖2-d可知，隨著酶解溫度的升高，膠原多肽得率呈現先上升后下降的趨勢，當酶解溫度為50 ℃時，膠原多肽得率達到最大值40.72 %(P<0.05)，其原因是溫度過高會導致復合蛋白酶的酶活力下降甚至失活，產物形成的方向發生改變[22]，這與圖2-c中過低或過高的pH會導致膠原多肽得率和水解度降低的解釋相一致。由圖2-e可知，隨著酶解時間的增加，膠原多肽得率呈現先上升后下降的趨勢，而水解度呈現先上升后趨于平穩的趨勢，在當酶解時間為4 h時，膠原多肽得率達到最大值(49.59%)(P<0.05)。當酶解反應開始后，酶與底物激烈反應，使原料的水解度和膠原多肽得率增大，但隨著酶解時間的延長，膠原多肽會被過度水解成氨基酸，使得膠原多肽得率下降[27]。

a-液料比；b-酶添加量；c-pH；d-酶解溫度；e-酶解時間

2.3 響應面優化試驗結果

2.3.1 響應面試驗設計及結果分析

根據單因素試驗結果，選取酶添加量(A)、酶解溫度(B)、酶解時間(C)3因素，利用Box-Behnken中心組合原理設計3因素3水平的響應面試驗，試驗結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計和膠原多肽得率結果

對表2中的試驗結果進行回歸分析，得到二次多項式方程：Y=48.57+0.80A+0.98B+1.81C+0.76AB+0.75AC+2.500E-003BC-3.99A2-5.05B2-2.38C2，回歸模型方差分析和系數顯著性結果如表3所示。

表3 回歸模型方差分析和系數顯著性檢驗

2.3.2 各因素相互作用分析

酶添加量(A)、酶解溫度(B)、酶解時間(C)之間交互作用的響應面圖和等高線圖如圖3所示，可直觀分析2個因素之間交互作用對膠原多肽得率的影響程度。等高線的形狀可反映出各因素相互作用的強弱，橢圓形則代表2個因素交互作用具有顯著影響，而接近圓形則代表不顯著。由表3和圖3分析可知，因素A、B、C、A2、B2、C2項對膠原多肽得率的影響呈現極顯著水平(P<0.01)，因素A和B交互作用的等高線圖呈橢圓形，對膠原多肽得率的影響具有顯著差異(P<0.05)，而因素A和C、因素B和C之間的交互作用呈圓形，對膠原多肽得率沒有顯著影響。由圖3結合表3中的F值分析可知，各因素對膠原多肽得率的影響次序：酶解時間>酶解溫度>酶添加量，剔除不顯著項AC、BC，模型方程進行優化得到：Y=48.57+0.80A+0.98B+1.81C+0.76AB-3.99A2-5.05B2-2.38C2。

圖3 酶添加量、酶解溫度和酶解時間交互作用對膠原多肽得率的影響

2.3.3 最優條件的驗證

采用軟件對優化后的回歸方程分析可知，當酶添加量為8 220.30 U/g、酶解溫度為51.06 ℃、酶解時間為4.38 h時，此時的膠原多肽得率最高，其理論值為49.00 %。按照該條件進行驗證試驗，為了方便操作，選取酶添加量為8 220 U/g、酶解溫度為51℃、酶解時間為4.5 h時，驗證實驗重復3次，測定膠原多肽得率為(49.00±0.80) %，非常接近理論值，無顯著性差異(P>0.05)，此條件是膠原多肽制備的最優條件，證明該模型方程可行。

2.4 膠原多肽分子質量分布情況

標準品及其混標的HPLC色譜圖如圖4-a所示，依據標準品與保留時間的關系，以相對分子質量的對數(lg MW)對保留時間(T)作線性回歸得到相對分子質量校正曲線，如圖4-b所示，其相對分子質量校正曲線方程：lg MW=6.821 42-0.246 15T(R2=0.997 05)。表明相對分子質量的對數(lg MW)與保留時間T(min)具有良好的線性關系，根據膠原多肽的出峰時間和相對分子質量校正曲線方程，可計算膠原多肽粉末各組分的分子質量。

a-液相色譜；b-校正曲線

魚骨膠原多肽粉末的HPLC色譜圖和分子質量分布如圖5和表4所示，圖中主要出現5個峰，表明魚骨膠原多肽是由5種不同分子質量膠原多肽組分所組成，且膠原多肽分子質量分布廣，大小不一。由圖5和表4可知，利用復合蛋白酶對魚骨粉酶解，其膠原多肽主要集中在組分Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，分子質量為400～3 000 Da，且組分Ⅲ含量最高，約為56.58 %。根據膠原多肽分子質量分布的HPLC色譜圖，采用Sephadex G-25分子層析將其分離純化。

圖5 魚骨膠原多肽的高效液相色譜圖

2.5 Sephadex G-25分子篩層析

凝膠過濾是一種基于分子質量大小分離肽的有效方法，已經被廣泛用于混合組分多肽的分離[28]。魚骨膠原多肽經Sephadex G-25柱洗脫分離之后的圖譜及各組分含量如圖6和表5所示。魚骨膠原多肽被分離成5個組分，凍干后組分Ⅰ～Ⅴ的質量分數分別為5.50%、28.49%、36.25%、7.55%和1.26%，組分Ⅲ的響應值和含量最高(P<0.05)。除去在分離過程中的損失量，其各組分的相對含量與HPLC的結果基本一致。其中，組分Ⅴ的含量低，分離1次僅有(2.53±0.04)mg的收集量，因考慮時間、經濟成本等具體影響，故收集前4個組分作為后續的研究對象。

表4 魚骨膠原多肽不同組分的分子量及相對含量

注：相對含量的數據來源于HPLC。

圖6 魚骨膠原多肽的Sephadex G-25注洗脫圖譜

表5 不同膠原多肽組分的含量

注：酶解液濃度為100 mg/mL，一次上樣體積2 mL。

2.6 氨基酸組成分析

對樣品進行氨基酸組成分析，其含量如表6所示。

表6 膠原多肽及其組分的氨基酸含量比較

注：*表示該氨基酸為疏水氨基酸，#表示該氨基酸為必需氨基酸，ND表示末檢測出該氨基酸。

膠原多肽粉末中甘氨酸(Gly)含量最高，谷氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)、丙氨酸(Ala)和天冬氨酸(Asp)的含量也相對較高，符合膠原蛋白氨基酸組成特征[29]。且樣品分子質量較小，主要集中在400～3 000因此可以認為該粉末中主要成分是膠原多肽。當多肽的N-端或C-端存在疏水氨基酸時，有利于多肽在脂質中的溶解，從而提高其抗氧化活性[30-31]，如SONG等[30]使用內源性蛋白酶對魷魚內臟進行酶解，其水解物中疏水氨基酸的相對含量達到38.52%，有助于形成疏水結構，使得其具有顯著的抗氧化性。如表6所示，膠原多肽粉末的疏水氨基酸含量僅有33.42 %，經Sephadex G-25柱洗脫之后，組分Ⅲ和組分Ⅳ的疏水氨基酸含量增加，分別為40.45 %和44.37%。除此之外，膠原多肽和各組分含有一定量的必需氨基酸。綜上所述，鰱魚骨膠原多肽中某些組分可以作為一種高營養的抗氧化劑膳食補充劑。

2.7 體外抗氧化實驗結果

2.7.1 ABTS+·清除能力

膠原多肽及其各組分的ABTS+·清除能力如圖7所示，其IC50值如表7所示。在樣品的測試濃度(0.015～1.0 mg/mL)，所有樣品均具有較好的ABTS+·清除能力，且ABTS+·清除能力隨著樣品濃度的遞增而增加。組分Ⅳ具有最強的ABTS+·清除能力(P< 0.05)，其IC50值為0.02 mg/mL，明顯低于膠原多肽粉末(IC50=0.15 mg/mL)、組分Ⅲ(IC50=0.47 mg/mL)、組分Ⅱ(IC50=0.69 mg/mL)和組分Ⅰ(IC50=0.74 mg/mL)，略高于GSH(IC50=0.01 mg/mL)。由表6可知，組分Ⅳ的疏水氨基酸含量最高，使其抗氧化性增加；而膠原多肽粉末的ABTS+·清除能力卻強于組分Ⅲ，這是因為一些非疏水氨基酸，如Gly、Asp和Lys，其含量的高低也與抗氧化活性有關[32-33]，而膠原多肽中的Gly、Asp和Lys含量遠高于組分Ⅲ，故導致膠原多肽粉末的ABTS+·清除能力強于組分Ⅲ。CHI等[34]從大黃魚肉中分離出3種抗氧化肽，其中ABTS+·清除能力最高的5肽， IC50為0.31 mg/mL，其抗氧化活性低于組分Ⅳ。

圖7 膠原多肽及其不同組分的ABTS+·清除能力

表7 膠原多肽及其不同組分的ABTS+·清除能力 的IC50值和還原能力的OD1.0值

注：ND表示末檢測。

2.7.2 還原能力

樣品中的還原劑能將鐵氰化鉀(Fe+3)還原成亞鐵氰化鉀(Fe2+)，進一步和FeCl3反應生成在700 nm處具有最大吸光度的普魯士藍，其吸光值越大，則表示還原能力及抗氧化性越強[35-36]。鰱魚骨膠原多肽及其組分的還原能力如圖8所示，其OD1.0值如表7所示。在樣品的測試濃度(0～50 mg/mL)，所有樣品均有還原能力，且還原能力隨著樣品濃度的遞增而增加。組分Ⅳ具有最強的還原能力(P< 0.05)，其OD1.0值為19.16 mg/mL，明顯低于膠原多肽粉末(OD1.0=21.85 mg/mL)、組分Ⅲ(OD1.0=47.49 mg/mL)、組分Ⅰ和組分Ⅱ，高于GSH(OD1.0=0.86 mg/mL)，各樣品的還原能力結果與ABTS+·清除能力基本一致。楊露等[5]制備的馬面魚骨多肽在50 mg/mL的A700 nm的值僅約為0.4，其還原能力遠低于本論文的膠原多肽粉末和各組分。

圖8 膠原多肽及其不同組分的還原能力

3 結論

本論文以鰱魚骨為原材料，以膠原多肽得率結合水解度為指標，篩選出復合蛋白酶為制備魚骨中膠原多肽的最優酶。通過單因素實驗、響應面優化確定鰱魚骨制備膠原多肽的最佳工藝條件為：酶添加量為8 220 U/g、酶解溫度為51℃、酶解時間為4.5 h，此時，膠原多肽得率為49.00 %。通過高效體積排阻色譜法分析得出其膠原多肽由5個組分組成，分子質量主要集中在400～3 000 Da。經Sephadex G-25過濾色譜法分離，各組分都具有一定的抗氧化能力，其中組分Ⅳ的ABTS+·清除能力和還原能力最高，其IC50和OD1.0值分別為0.02 mg/mL和19.16 mg/mL。本實驗的研究可為制備高抗氧化魚骨多肽提供數據支撐，也可為提高魚骨資源利用率提供理論依據。