老鹽水中乳酸菌的篩選鑒定及其在青菜頭泡菜中的應用

劉玉凌，任亭，彭玉梅，曾勝，賀云川，楊波，欒興霞，李君紅，羅遠莉*

1(重慶市渝東南農業科學院，重慶， 408000)2(重慶市涪陵榨菜集團股份有限公司，重慶, 408000)

泡菜是以各種新鮮蔬菜為原料，利用其表面乳酸菌主導發酵而成，其營養豐富、風味優雅、富含功能菌群，可增食欲、助消化、促健康，是我國傳統的發酵蔬菜制品[1]。涪陵青菜頭、紅心蘿卜，都是重慶市涪陵區地方特色蔬菜，用青菜頭和紅心蘿卜制作的泡菜具有色澤艷麗、開胃解油膩、爽口增食欲等特點，是本地人們最喜愛的佐餐小菜，但絕大多數都是本地農戶依靠自然發酵自制而成，其發酵時間長、受外界因素影響大、產品質量波動大，很難大規模生產。隨著分子生物學技術的快速發展，泡菜發酵微生物群落組成、分布及其動態變化的神秘面紗也逐漸被揭開。近年來研究發現，傳統四川泡菜鹽水中主要優勢菌群有乳桿菌屬、片球菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌屬等，隨著泡菜鹽水的持續循環使用，優勢菌群越來越單一，但乳桿菌屬始終是優勢菌群[2-3]。通過分離篩選優良菌株制作發酵劑，利用人工接種發酵已成為傳統泡菜工業化生產的發展趨勢，張夢梅等[4]采用人工接種植物乳桿菌和腸膜明串珠菌發酵白菜發現人工接種可以增加泡菜必需氨基酸含量，賦予泡菜更鮮美的滋味，提高感官品質。XIA等[5]研究發現短乳桿菌可降低泡菜pH值和亞硝峰，提高食用安全性。JANG等[6]研究發現人工接種乳酸鏈球菌可以降低乳酸含量，延長最佳發酵期。腸膜明串珠菌是發酵初期到中期的主要菌株，接種腸膜明串珠菌能在泡菜發酵初期快速啟動發酵，代謝產物多于未接種發酵泡菜，具有高產酸、迅速降低pH值和拮抗致病菌的能力[7-9]。樸泓潔等[10]研究表明，接種腸膜明串珠菌可以縮短發酵周期、增進泡菜滋味、提高泡菜整體品質。但人工接種發酵在涪陵青菜頭泡菜中的應用還未見報道，因此，本研究從農家自制老鹽水中分離篩選乳酸菌，并將篩選出的優勢乳酸菌結合腸膜明串珠菌制備復合發酵劑接種到泡菜中，分析接種發酵對泡菜發酵過程中理化性質、感官的影響，為復合發酵劑的研制及其工業化應用提供理論數據。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與試劑

新鮮青菜頭、紅心蘿卜、香辛輔料，重慶市涪陵區南門山農貿市場。老鹽水，涪陵區農戶家陳年泡菜水。

腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)，中國工業微生物菌種保藏管理中心 (CICC 21861)，分離自泡豬耳朵。

MRS培養基，北京陸橋技術有限責任公司；NaOH、硼砂、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅(均為分析純)，成都市科龍化工試劑廠；對氨基苯磺酸鹽酸萘乙二胺(分析純)，天津市光復精細化工研究所；NaNO2(分析純),廣州市全華大化學試劑有限公司；冰乙酸、HCl(分析純)，重慶川東化工(集團)有限公司；CuSO4、亞甲藍、溴甲酚紫、水楊酸、酒石酸鉀鈉(分析純)，上海麥克林生化科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、2 × Taq PCR MasterMix,天根生化科技有限公司；DNA Marker、溶菌酶,寶生物工程(大連)有限公司；通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′),上海立菲生物技術有限公司(北京)。

1.2 儀器與設備

LDZH-150L 立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；PHSJ-3F 酸度計，上海精密科學儀器有限公司；L5S 紫外可見分光光度計，上海儀電分析器有限公司；DHP-9162 電熱恒溫培養箱，上海齊欣科學儀器有限公司；LA8080 日立全自動氨基酸自動分析儀，天美(中國)科學儀器有限公司。

1.3 乳酸菌的分離篩選

采用梯度稀釋涂布法對樣品中乳酸菌進行分離篩選，吸取25 mL老鹽水加入到225 mL無菌生理鹽水中，用渦旋振蕩器搖勻，制得10-1的稀釋液，再從中吸取1 mL稀釋液到9 mL無菌生理鹽水中制得10-2的稀釋液，按此法依次制得10-3、10-4、10-5、10-6的稀釋液。分別取100 μL稀釋液于改良MRS培養基(在MRS培養基中添加0.4 g/L的溴甲酚紫)涂布，置于37 ℃下培養48 h。挑取黃色的單菌落[11]進行反復平板劃線純化3次，再挑取單菌落分別進行革蘭氏染色和過氧化氫酶實驗，觀察并記錄結果。將分離純化后的單菌落接種在MRS肉湯中于37 ℃下培養48 h后，與25%甘油按體積比1∶1混合后于-20℃冰箱保存并編號。

1.4 乳酸菌的鑒定

1.4.1 生理生化鑒定

參照潘曉倩等[12]的方法，采用VITEK 2 Compact機器配套CBC鑒定卡進行鑒定。

1.4.2 16S rDNA分子生物學鑒定

采用細菌基因組提取試劑盒提取細菌基因組DNA，利用通用引物對16S rDNA序列進行擴增，PCR反應體系(50 μL)：上下游引物各1 μL、DNA模板2 μL、2×Taq PCR MasterMix 25 μL、超純水21 μL；PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環35次；72 ℃延伸10 min。PCR產物由中國食品發酵研究院有限公司進行序列測定。

1.5 接種發酵泡菜

1.5.1 復合發酵劑制備

將-20℃冰箱保存的菌株于MRS培養基上活化后，挑取單菌落于MRS肉湯中37 ℃培養48 h，4 500 r/min離心10 min，棄去上清液，加無菌生理鹽水離心洗滌2次，棄去上清液，再加入原培養基體積1/2的無菌生理鹽水制得菌懸液(濃度107～108CFU/mL)，腸膜明串珠菌與乳酸菌ZP11-2菌懸液以體積比1∶1混均得復合乳酸菌發酵劑，混合后立刻接種。

1.5.2 接種發酵青菜頭

青菜頭、紅心蘿卜清洗瀝干水分后切塊，按m(青菜頭)：m(紅心蘿卜)：m(涼開水)(鹽質量濃度40 g/L)=1∶0.2∶1入壇，再添加冰糖、姜、大蒜、辣椒、花椒，分別按1%接種量添加腸膜明串珠菌、乳酸菌ZP11-2和復合乳酸菌發酵劑，于25 ℃密封發酵。對照組為未接種的自然發酵組，其他工藝和配方與接種發酵組相同。在發酵第0、1、2、3、5、7、9天取泡菜水進行各項指標的檢測。

1.6 理化分析

1.6.1 乳酸菌測定

參照GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》中的方法。

1.6.2 pH值和總酸測定

pH值采用pH計測定，總酸參照GB/T 12456—2008 《食品中總酸的測定》中的酸堿滴定法。

1.6.3 亞硝酸鹽測定

參照國標GB/5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的分光光度法。

1.6.4 游離氨基酸測定

準備取泡菜水樣品1 mL于2 mL塑料離心管中，加入0.5 mL 100 g/L磺基水楊酸溶液振蕩搖勻。冰箱靜置12 h后于13 000 r/min離心2 min，用0.22 μm濾膜過濾，取濾液采用氨基酸自動分析儀進行測定。

氨基酸分析儀色譜分析條件：日立專用離子交換樹脂，4.6 mm ID×60 mm；檢測器：紫外；流速：0.25 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫度：55 ℃；反應溫度：135 ℃；柱壓：50 kg/cm2。

1.6.5 感官評價

參照文獻[1, 13]的方法略有改動，總分100分，色澤、香氣、滋味、質地4個項目各占25分，選擇10位專業人員組成感官評定小組，通過盲評計分，對泡菜色澤、香氣、滋味、質地進行打分，具體評分標準見表1。

表1 感官評分標準

1.7 數據分析

數據平均測定3次，結果以(平均值±標準差)表示，并采用SPSS 17.0進行方差分析，Origin 8.1進行相關圖的繪制。

2 結果與分析

2.1 菌株ZP11-2的鑒定

2.1.1 形態學與生理生化鑒定

菌株ZP11-2,分離自川渝地區農戶家自制老鹽水，在MRS培養基上30 ℃培養48 h后長勢良好，菌落呈白色，圓形，表面濕潤，不透明，邊緣不整齊；接觸酶陰性，革蘭氏染色陽性，菌體呈桿狀，(0.3～0.5) μm×(1.1～2.1) μm，單個或成對排列，并進一步做了生理生化鑒定，結果如表2所示。

表2 菌株ZP11-2的生理生化結果

注：“+”表示陽性；“+w”表示弱陽性；“-”表示陰性。

2.1.2 16S rDNA分子生物學鑒定

經PCR擴增和序列測定，獲得菌株ZP11-2的16S rDNA序列片段，與GenBank中LactobacillusbrevisATCC 14869T登錄號為 KI271266的序列同源性達到99.93%，并采用MEGA5.0軟件，鄰位連接法顯示與相關種的16S rDNA序列系統發育樹(如圖1所示)，進行1 000次的相似度重復計算，因此確定菌株ZP11-2為短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)。

2.2 乳酸菌、pH值和總酸變化

乳酸菌是泡菜發酵的主要優勢菌群，其菌落數的動態變化能直觀反映整個發酵過程[14]。由圖2-A可知，乳酸菌在發酵第0～5天增長較快，5～9 d相對比較平穩，人工接種發酵泡菜中乳酸菌含量始終高于自然發酵。發酵初期0～2 d，人工接種復合發酵劑和單一菌株發酵泡菜中乳酸菌增長速率差異不大，但人工接種復合發酵劑乳酸菌數量在第2天數量達到最高9.45 lg CFU/mL，而自然發酵后期還在緩慢增長。乳酸菌發酵產酸，其數量的變化直接影響pH值和總酸的變化。一般以為，泡菜液pH值達到3.5～3.8時，即為發酵成熟，此時風味在理論上達到最佳[15]。由圖2-B、圖2-C可看出，青菜頭泡菜在整個發酵過程中，隨發酵時間的延長pH值呈下降趨勢，總酸呈上升趨勢，7 d后均趨于穩定。在發酵初期，人工接種復合發酵劑發酵pH值、總酸變化幅度較大，第5天時分別為3.47、2.08 g/kg，基本達到穩定，但人工接種單一菌株和復合發酵劑之間差異不大；自然發酵pH值、總酸變化幅度相對緩慢，在第7天(3.48、2.34 g/kg)才趨于穩定，這與乳酸菌菌落數的變化規律相符。因為在人工接種發酵泡菜水中乳酸菌初始含量較多，生長成優勢菌群較快，產酸也較多；自然發酵泡菜水中乳酸菌開始比較少，繁殖所需周期較長，形成優勢菌群所需時間也越長[16]，所以產酸速率和產酸量都要低于人工接種發酵，這也說明人工接種發酵能加快青菜頭泡菜成熟速度，縮短其發酵周期。

a-乳酸菌菌落數；b-pH值；c-總酸含量

2.3 亞硝酸鹽變化

如圖3所示，人工接種發酵與自然發酵青菜頭泡菜中亞硝酸鹽含量均呈先增加后降低的趨勢，亞硝峰均出現在發酵第2天，其中人工接種復合發酵劑亞硝峰最低，含量僅為1.53 mg/kg，明顯低于接種單一菌株腸膜明串珠菌(3.75 mg/kg)、短乳桿菌(2.60 mg/kg)和自然發酵亞硝峰(7.52 mg/kg)。因為在發酵初期，在硝酸還原酶的作用下，青菜頭本身帶有的硝酸鹽被還原成亞硝酸鹽形成亞硝峰[17]，而人工接種發酵初始乳酸菌含量較多并迅速生長，乳酸菌中含有亞硝酸還原酶能分解亞硝酸鹽，降低亞硝酸鹽的含量；自然發酵雜菌多，乳酸菌相對較少，含硝酸鹽還原酶的菌將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，形成亞硝峰[18-19]。這說明人工接種乳酸菌發酵可以降低青菜頭泡菜的亞硝峰，提高其食用安全性，且采用復合發酵劑接種發酵更有利于青菜頭泡菜的使用安全。

圖3 青菜頭泡菜發酵過程中亞硝酸鹽變化

2.4 游離氨基酸分析

表3中顯示發酵成熟時泡菜中游離氨基酸含量。依據氨基酸的呈味特性可將氨基酸分為鮮味氨基酸(天門冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸)、甜味氨基酸(絲氨酸、蘇氨酸、組氨酸、脯氨酸)、苦味氨基酸(精氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸)和芳香族氨基酸(半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)[20]。由表3可知，人工接種發酵泡菜中共檢測出游離氨基酸16種，比自然發酵泡菜多檢測出1種人體必需氨基酸(組氨酸)，組氨酸為小兒生長發育期間必須氨基酸。人工接種發酵泡菜中游離氨基酸總量、必需氨基酸含量均高于自然發酵；人工接種復合發酵劑泡菜中游離氨基酸總量、必需氨基酸含量分別高達68.8、17.36 mg/100mL，均顯著高于人工接種單一菌株和自然發酵(P<0.05)。游離氨基酸可被人體直接吸收，是人體VE、葉酸的營養來源，其含量和多樣的味感能反應食品的營養價值和味覺感受[21]。這說明人工接種復合發酵劑發酵能賦予青菜頭泡菜更好的營養價值和較好的口感，這與感官評價結果一致。

所有呈味氨基酸中，鮮味氨基酸﹥苦味氨基酸﹥甜味氨基酸﹥芳香族氨基酸，其中貢獻較大的是谷氨酸和丙氨酸，在人工接種復合發酵劑泡菜中的含量分別為18.61和11.29 mg/100mL，共占游離氨基酸總量的43.46%，且都顯著高于人工接種單一菌株和自然發酵(P<0.05)，這兩種呈味物質的閾值也相對較低[22]，易被品嘗出；雖然人工接種復合發酵劑發酵泡菜中苦味氨基酸含量也顯著高于單一菌株和自然發酵(P<0.05)，但并非所有的苦味都是不好的，相關研究表明,有些苦味肽具有促進生長發育、免疫調節、抗病毒、抗高血壓、預防慢性疾病等生理功能[23]，且大部分苦味氨基酸的閾值較高，不易被品嘗出。

表3 青菜頭泡菜中游離氨基酸組成 單位：mg/100 mL

注：同行肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)。表4同。“﹣”表示未檢測出；“*”表示必需氨基酸。

2.5 感官分析

由表4可知，人工接種發酵對青菜頭泡菜感官品質具有一定的影響，且人工接種復合發酵劑發酵的成熟青菜頭泡菜感官評價總分高于接種單一菌株和自然發酵，兩種單一菌株間差異不顯著(P<0.05)，但都高于自然發酵。人工接種復合發酵劑能顯著提高青菜頭泡菜的色澤和質地(P<0.05)，賦予其較濃郁的滋味，接種復合發酵劑的青菜頭泡菜色澤均勻艷麗、酸甜適中、清脆爽口，具有青菜頭泡菜特有的香氣，更受大家喜歡。

表4 感官評價結果

3 結論

從本地農戶家自制的老鹽水中分離篩選出1株優勢乳酸菌，通過形態學、生理生化和分子鑒定確定該菌株為短乳桿菌。結合腸膜明串珠菌制備復合發酵劑接種發酵青菜頭泡菜，以自然發酵作為實驗對照組，結果發現，人工接種發酵在發酵初期能快速啟動發酵，增加乳酸菌和總酸含量、降低pH值，人工接種單一菌株和復合發酵劑之間差異不大，但人工接種復合發酵劑降亞硝峰能力優于單一菌株，使亞硝酸鹽含量控制在1.53 mg/kg以內；人工接種復合發酵劑能顯著增加青菜頭泡菜中游離氨基酸總量、必需氨基酸和呈味氨基酸含量(P<0.05)，且其含量顯著高于單一菌株和自然發酵(P<0.05)，賦予青菜頭泡菜較濃郁的滋味；感官評價結果顯示，人工接種發酵在色澤、質地方面顯著優于自然發酵(P<0.05)，酸甜適中，滋味濃郁，清脆爽口，具有青菜頭泡菜特有的香氣，整體更受歡迎。

綜上所述，人工接種復合發酵劑能夠快速啟動青菜頭泡菜發酵，縮短發酵周期，增加游離氨基酸含量，降低亞硝峰，提高食用安全性，為以后復合發酵劑的研制在泡菜上的應用提供一定的實驗基礎。由于泡菜微生物發酵是一個復雜體系，其作用機理和各微生物之間的相互作用還有待進一步研究。