高通量測序技術在主要洄游性魚類研究中的應用

王美垚 馮群

摘要?從轉錄組概念、Illumina測序原理及工作流程、Illumina測序技術中生物信息分析相關數據庫概念等方面，介紹了高通量測序技術的基本原理，以及該技術在重要洄游性魚類（鮭魚、鱘魚、刀鱭）研究中的應用，旨在為今后更好地開展水生資源修復奠定理論基礎。

關鍵詞?高通量測序;洄游;魚類

中圖分類號?S917.4文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2020）02-0013-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.02.004

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Utilization of High Throughput Sequencing in Major Anadromous Fish Species

WANG Mei-yao1，2，3，FENG Qun1?（1.Wuxi Fisheries College，Nanjing Agricultural University，Wuxi，Jiangsu 214081;2.Key Laboratory of Freshwater Fisheries and Germplasm Resources Utilization of Agriculture，Freshwater Fisheries Research Center，Chinese Academy of Fishery Sciences，Wuxi，Jiangsu 214081;3.Aquatic Animals Genome Center，Freshwater Fisheries Research Center，Chinese Academy of Fishery Sciences，Wuxi，Jiangsu 214081）

Abstract?This article introduced basic principles of high throughput sequencing and utilizaiton in major anadromous fish species（Oncorhynchus masou，Acipenser sinensis，Coilia ectenes），from transcriptome concepts，Illumina sequencing principle and workflow，database concepts related to bioinformatics analysis in Illumina sequencing technology.This article aimed at laying theoretical foundation for further research on aquatic resource recovery.

Key words?High hroughput sequencing;Anadromous;Fish species

高通量測序技術，又稱為第二代測序技術，相比第一代測序技術，其具有測序速度快、準確性高、信息量大的顯著特點，可以使研究者在更廣闊又更為深刻的層面上來開展科學研究[1-2]。洄游性魚類是現今水生資源修復工作中的重要內容，筆者總結了高通量測序技術在主要洄游性魚類研究中的應用，旨在為今后更好地開展水生資源修復奠定理論基礎。

1?高通量測序技術原理

1.1?轉錄組概念

轉錄組廣義上是指在某一生理狀態下，機體內特定細胞內全部轉錄產物的集合，包括信使RNA以及非編碼RNA如核糖體RNA、轉運RNA、小分子RNA等;狹義上是指信使RNA的集合[3-4]。同一細胞處于不同發育階段及不同的外界環境條件下，其基因表達情況是不同的，因而具有時間與空間特異性[5]。這也是與具有靜態特征的基因組學研究的顯著不同點，轉錄組受外源環境因子和內源因子的共同調控，反映了生物體的特定組織或器官處于某一生理狀態下，細胞內全部基因表達水平情況，通過比較不同組織或生理狀況下的基因表達差異，尋找與特定生理功能相關、發揮重要調控作用的通路、基因等[6]。轉錄組學研究是一種整體水平的研究方法，作為功能基因組學研究的重要手段，其改變了先前的單個基因的研究模式，大大促進了生物體基因組學的研究進展。

1.2?Illumina測序原理及工作流程?高通量測序技術又名“下一代測序技術”，包括第二代測序技術及第三代測序技術，具有測序速度快、準確性高且成本低等特性。高通量測序不同于以往的測序方法，可以在無參考基因組的情況下，以更快的速率獲得生物體某組織或器官在特定生理狀態下的整體轉錄水平[1-2]。現今應用較為廣泛的是第二代測序技術，主要包括羅氏公司的454焦磷酸測序技術[7]、Illumina公司的Solexa測序法[8]、ABI公司的SOLiD測序技術[9]以及Helicos公司的大規模并行單分子合成測序法[10]。

Illumina是一種邊合成邊測序的技術，是基于其核心技術“DNA簇”和“可逆末端終結”來進行的[8]。其工作原理為將DNA隨機打斷成較小的片段，芯片表面連接有一層與接頭互補的寡核苷酸，DNA片段通過接頭固定在芯片表面，產生DNA簇，形成PCR橋結構。而后開展PCR橋式擴增，每個分子可以形成1000個以上的單克隆DNA簇群。可逆終止子是帶有熒光標記的dNTP，在3′羥基端有可被化學切割的基團，可以封閉dNTP的3′端黏性，從而阻止下一個dNTP與之相連接。進行測序反應時，通過加入可逆終止子，檢測釋放的熒光信號，通過邊合成邊測序的方法獲得模板鏈的序列信息。

Illumina的工作流程大體包括如下四方面：①連接接頭：將待測樣品提取出的基因組DNA或RNA反轉錄組所得的cDNA打斷成長度為100～200 bp的較小片段，并在單鏈DNA片段兩端加上接頭。②形成DNA簇：芯片表面連接有一層引物堿基，加入接頭的DNA通過接頭使其一段固定在芯片上，另一端與最近的另一引物互補而固定，形成橋狀結構，通過PCR擴增后，同片段擴增1 000倍以上，所有的擴增產物均被固定到了芯片上，形成單克隆DNA簇。而后所有模板被線性化處理為單鏈模板。

③測序反應：采用邊合成邊測序方法，加入DNA聚合酶、引物以及4種可逆終止子dNTP進行擴增，測序儀通過捕捉熒光信號，而后通過計算機軟件將光信號轉換為測序峰，從而獲得測序片段的序列信息。④數據分析：讀取堿基，數據轉移至自動分析通道進行二次分析。

1.3?Illumina測序技術中生物信息分析相關數據庫概念

1.3.1?Nr（NCBI non-redundant protein sequences）數據庫。該數據庫是 NCBI 官方發布的非冗余蛋白序列數據庫，它包含有來自GenBank中基因編碼的蛋白序列以及來自Swiss Prot、PDB（Protein Data Bank）、PIR（Protein Information Resource）和PRF（Protein Research Foundation）等數據庫的蛋白序列信息。

1.3.2?Nt（NCBInucleotidesequences）數據庫。該數據庫是NCBI 官方發布的核酸序列數據庫，包含有GenBank、DDBJ以及EMBL數據庫中的核酸序列信息。

1.3.3?KOG（eukaryotic ortholog groups）數據庫。該數據庫是NCBI基于基因直系同源進化關系的蛋白數據庫，其主要針對真核生物。其是假定構成每個KOG的蛋白都是來自于同一個祖先蛋白，因此屬于直系同源蛋白以及旁系同源蛋白。其中直系同源蛋白是由不同物種的由垂直家系（物種形成）進化而來的蛋白，保留了原始蛋白的典型功能;旁系同源蛋白是來自于一定物種的基因復制蛋白，因而可能會進化出新的功能。

1.3.4?Swiss-Prot數據庫。該數據庫是由富有經驗的分子生物學家和蛋白質化學家搜集整理而成的蛋白序列數據庫。 每個注釋條目都含有結構域、功能位點等詳細信息。

1.3.5?GO（gene ontology）數據庫。該數據庫是一個國際標準化的基因功能分類體系，提供了一套動態更新的標準詞匯表來描述生物體中基因及其基因產物的分類屬性。GO分類系統具有3個本體，包括描述基因的分子功能、所處的細胞位置以及參與的生物過程三大子類。GO的基本單位為詞條，均具有相對應的屬性。

1.3.6?KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）數據庫。在生物體內，不同基因通過所處通路、相互協調從而發揮其生物學功能，通過通路顯著性富集分析能確定差異表達基因參與的最主要生化代謝途徑以及信號轉導途徑。

2?高通量測序技術在主要洄游性魚類研究中的應用

在刀鱭上也有基于高通量測序技術的研究報道。主要是集中在刀鱭不同組織如性腺組織的深度測序[11-13]，也有操作應激對刀鱭肝組織的影響研究[14]。有關刀鱭洄游中的關鍵通路及基因的轉錄組研究較少，僅見刀鱭嗅覺上皮的比較轉錄組分析研究[15]。

2.1?高通量測序技術在鮭魚研究中的應用?高通量測序技術在鮭魚研究上應用涉及的種類較多，包括大西洋鮭（S.salar）[16]、銀大麻哈魚（O.kisutch）[17]、紅大麻哈魚（Oncorhynchus nerka）[18]、大鱗大麻哈魚（O.tshawytscha）[19]等，現已開展了免疫學、營養學、繁殖學等的研究，其中免疫學方面的研究較多。如 Johansson等[20]開展了降海洄游中大西洋鮭頭腎、小腸以及鰓的免疫轉錄組研究。研究結果表明，頭腎、小腸中的基因差異表達顯著高于鰓中的。基因群包括先天抗病毒免疫、趨化因子、細胞因子及其受體、信號轉導子、體液及細胞免疫因子淋巴細胞等均出現了顯著的下調表達。海虱（Caligus rogercresseyi）是大西洋鮭魚體常攜帶的寄生蟲，嚴重時甚至會導致魚體死亡，因而有關海虱對大西洋鮭各組織的轉錄組研究也多有報道。如Núez-Acua等[16]開展了植食飼料添加劑對增強大西洋鮭抗海虱感染的轉錄組研究。選取頭腎、皮膚開展比較研究，結果表明免疫應答最為顯著的組織為頭腎，飼喂含有免疫增強效應物的飼料可以上調魚體代謝方面基因表達，另外，MHC-Ⅰ與MHC-Ⅱ在此過程中出現差異表達，來共同發揮免疫調節功用。Valenzuela-Muoz等[17]近期又開展了感染海虱后鐵離子調控在大西洋鮭魚與銀鮭的差異表達研究。選取頭腎以及皮膚開展研究，結果表明相比銀鮭，大西洋鮭更易感染海虱，且感染會較顯著影響細胞鐵離子的代謝。而海虱感染對銀鮭影響較小，會激活促炎性應答。Mueller等[18]還開展了紅大麻哈魚感染IHNV后的腦轉錄組影響研究，結果表明上調表達基因集中在抗體生成以及抗原呈遞方面;下調表達基因主要與膽固醇合成有關。Valenzuela-Miranda等[21]開展了ISAV感染對大西洋鮭頭腎、肝、鰓組織的轉錄組影響研究，研究表明差異表達基因多是與干擾素通路、先天免疫應答以及細胞繁殖與分化相關。另外，在應答過程中，各組織內部通路受到獨立調控。Dahle等[22]開展了大西洋鮭感染PRV后紅細胞轉錄組分析研究，研究表明感染后，一些病毒應答相關基因出現顯著表達，涉及干擾素調控的抗病毒基因以及MHC-Ⅰ抗原遞呈基因。同時PRV感染也引起了免疫負調節子的表達，包括一些免疫基因、細胞骨架相關組分基因以及離子交換、細胞互作、生長與分化調節因子等基因的下調表達。

在營養學方面，主要開展了飼料添加劑對大西洋鮭消化等的影響研究。如Król等[23]開展了植物蛋白飼料對大西洋鮭腸轉錄組的影響研究，結果表明混合型植物蛋白飼料在改善魚體組成等方面功能優于單一組分植物蛋白飼料。De Santis等[24]開展了不同替代水平的蠶豆蛋白飼料對大西洋鮭肝轉錄組的影響研究，研究表明大西洋鮭可利用中度替代水平的蠶豆蛋白飼料，最適添加量為120 g/kg。同年，De Santis等[24]開展了不同磷脂添加水平及組成的飼料對大西洋鮭腸轉錄組影響研究，結果表明，發育早期增加磷脂添加量可以對魚體腸道轉錄組產生影響，而幼魚期增大添加可以促進生長，但是對腸道轉錄組基因無顯著作用。

在繁殖學方面，為了探討上皮組織在大西洋鮭性成熟中的調控作用，Palstra等[25]開展了馬蘇大麻哈魚上皮轉錄組的比較研究，發現了75個已知的以及27個未知的發揮重要作用的差異表達基因。Gomez-Uchida等[19]開展了大鱗大麻哈魚精巢的轉錄組測序研究，獲得了大量的基因及GO、KEGG富集通路信息，為今后進一步開展大鱗大麻哈魚的相關研究奠定了理論基礎。另外，有關鮭魚研究多是集中在大西洋鮭上，Kim等[26]還開展了銀鮭13個組織的轉錄組研究，為后續進一步開展銀鮭這一物種的相關研究奠定了理論基礎。

2.2?高通量測序技術在鱘魚研究中的應用

有關鱘魚的高通量測序研究涉及的種類也較多，包括史氏鱘（A.schrenckii）[27]、中華鱘（A.sinensis）[28]、俄羅斯鱘（A.gueldenstaedtii）[29]、意大利鱘（A.naccarii）[30]等，主要集中在性腺組織、免疫組織測序等理論基礎研究方面。如Chen等[29]選取不同發育階段俄羅斯鱘的性腺組織開展了高通量測序研究，結果表明信號轉導相關基因富集最顯著，體現了信號轉導機制對于俄羅斯鱘性腺發育的調控作用。雌性個體的蛋白合成、細胞色素C氧化酶亞單元、核糖體蛋白等相關基因表達顯著高于雄性個體，雄性個體在轉座元件轉座酶、反轉錄酶以及轉座酶等相關基因表達方面高于雌性。Jin等[27]開展了史氏鱘精巢及卵巢的比較轉錄組研究，獲得了1 309個差異表達基因，精巢中有782個基因上調表達，卵巢中出現527個基因上調表達。Yuan等[31]開展了史氏鱘miRNA的高通量測序研究，獲得了103個miRNA，其中58個具有強烈的檢測信號，25個miRNA在5個檢測的組織中均有表達。Yue等[28]開展了中華鱘的精巢與卵巢的轉錄組測序及比較研究，獲得了1 896個差異表達基因，其中1 894個基因在卵巢中出現上調表達，2個基因在精巢中出現上調表達。Vidotto等[30]開展了意大利鱘性腺以及腦組織的高通量測序研究，獲得了32個性別相關基因，并發現了其中7個關鍵基因，在后續的組織學檢測中發現其中5個位于雄性個體中，其余2個位于雌性個體中。Jin等[27]開展了多肽激素Kp處理對史氏鱘腦部下丘腦-垂體-性腺軸的轉錄組影響研究，研究表明多肽激素Kp將會引起G蛋白偶聯受體54、促性腺激素釋放激素、雄激素受體、雌激素受體等基因的上調表達。Zhu等[32]首次開展了中華鱘免疫組織的高通量測序研究，獲得了67 000 000的高質量讀本以及91 739個基因序列。GO及KEGG富集分析結果表明獲得的大量免疫相關基因包括PRR信號通路、JAK-STAT信號通路、補體凝集通路、T細胞受體與B細胞受體信號通路等。為進一步開展該物種的相關研究奠定了理論基礎。

2.3?高通量測序技術在刀鱭研究中的應用

高通量測序技術也已應用在刀鱭的相關研究上，但總體來說，研究較少。已見有關刀鱭不同組織的深度測序研究報道[11-13]，Duan等[12]開展了刀鱭卵巢組織的轉錄組研究，獲得了63 141個基因。其中8 570個基因注釋到了COG的25個條目中，12 358個基因注釋到了234條KEGG通路中。Shen等[13]開展了刀鱭10個組織包括腦、鰓、心、腸、腎、肝、肌肉、胃、卵巢以及精巢組織的高通量測序研究，共獲得了65 350個非冗余轉錄本，序列平均長度為1 520 bp，其中15 055個基因注釋到了COG的25個條目中，40 688個基因被注釋到GO條目中，32 882個基因富集到了KEGG通路上。另外，Du等[14]也開展了急性操作應激對刀鱭肝組織轉錄組的影響研究，獲得了6 406個差異表達基因。其中，3 416個基因出現下調表達，2 990個基因出現上調表達。KEGG富集分析結果表明，最顯著富集的通路集中在代謝相關包括糖以及脂代謝等。另外，也有有關刀鱭洄游機理的關鍵通路及基因的高通量研究報道，例如Zhu等[15]開展的刀鱭嗅覺上皮的比較轉錄組分析研究，試驗選取野生洄游刀鱭以及非洄游刀鱭上皮組織開展研究，研究表明差異表達基因集中在信號轉導通路以及酶活性調節相關通路。同時也發現許多對洄游行為發揮調控作用的基因包括嗅覺受體、環核苷酸門控陽離子通道、依賴鈣離子激活的氯離子通道、光傳感因子、G蛋白受體激酶等基因。

3?展望

高通量測序技術已成為深入開展科學研究的有效手段，在人、哺乳動物、魚類等均有廣泛的應用。洄游性魚類是水生資源修復中的重要組成部分，但其魚體調控機制個體差異性明顯，今后還應針對物種自身特性應用高通量測序技術開展深入研究，為更好實現水生生物資源修復奠定理論基礎。參考文獻

[1] MARDIS E R.The impact of next-generation sequencing technology on genetics[J].Trends in genetics，2008，24（3）：133-141.

[2] SCHUSTER S C.Next-generation sequencing transforms today's biology[J].Nature methods，2008，5（1）：16-18.

[3] 祁云霞，劉永斌，榮威恒.轉錄組研究新技術：RNA-Seq及其應用[J].遺傳，2011，33（11）：1191-1202.

[4] 田英芳，張曉政，周錦龍.轉錄組學研究進展及應用[J].中國生物教學，2013（12）：29-31.

[5] MUTZ K O，HEILKENBRINKER A，LNNE M，et al.Transcriptome analysis using next-generation sequencing[J].Current opinion in biotechnology，2013，24（1）：22-30.

[6] WANG Z，GERSTEIN M，SNYDER M.RNA-Seq：A revolutionary tool for transcriptomics[J].Nature reviews genetics，2009，10（1）：57-63.

[7] MARGULIES M，EGHOLM M，ALTMAN W E，et al.Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors[J].Nature，2005，437（7075）：376-380.

[8] SHENDURE J，PORRECA G J，REPPAS N B，et al.Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome[J].Science，2005，309（5741）：1728-1732.

[9] FEDURCO M，ROMIEU A，WILLIAMS S，et al.BTA，a novel reagent for DNA attachment on glass and efficient generation of soilid-phase amplified DNA colonies[J].Nucleic acids research，2006，34（3）：1-13.

[10] HARRIS T D，BUZBY P R，BABCOCK H，et al.Single-molecule DNA sequencing of a viral genome[J].Science，2008，320（5872）：106-109.

[11] ZHOU Y F，DUAN J R，LIU K，et al.Testes transcriptome profiles of the anadromous fish Coilia nasus during the onset of spermatogenesis[J].Marine genomics，2015，24：241-243.

[12]DUAN J R，ZHOU Y F，XU D P，et al.Ovary transcriptome profiling of Coilia nasus during spawning migration stages by Illumina sequencing[J].Marine genomics，2015，21：17-19.

[13] SHEN H S，GU R B，XU G C，et al.In-depth transcriptome analysis of Coilia ectenes，an important fish resource in the Yangtze River：de novo，assembly，gene annotation[J].Marine genomics，2015，23：15-17.

[14] DU F K，XU G C，NIE Z J，et al.Transcriptome analysis gene expression in the liver of Coilia nasus during the stress response[J].BMC Genomics，2014，15：1-11.

[15] ZHU G L，WANG L J，TANG W Q，et al.De novotranscriptomes of olfactory epithelium reveal the genes and pathways for spawning migration in Japanese grenadier anchovy （Coilia nasus）[J/OL].PLoS One，2014，9（8）：e103832[2018-11-20].https：//doi.org/10.1371/journal.pone.0103832.

[16] NEZ-ACUA G，GONC ALVES A T，VALENZUELA-MUOZ V，et al.Transcriptome immunomodulation of in-feed additives in Atlantic salmonSalmo salarinfested with sea lice Caligus rogercresseyi[J].Fish & shellfish immunology，2015，47（1）：450-460.

[17] VALENZUELA-MUOZ V，BOLTAA S，GALLARDO-ESCRATE C.Uncovering iron regulation with species-specific transcriptome patterns in Atlantic and coho salmon during a Caligus rogercresseyi infestation [J].Journal of fish diseases，2017，40（9）：1169-1184.

[18] MELLER A，SUTHERLAND B J G，KOOP B F，et al.Infectious hematopoietic necrosis virus （IHNV） persistence in Sockeye Salmon：Influence on braintranscriptome and subsequent response to the viral mimic poly（I：C）[J].BMC Genomics，2015，16：1-19.

[19] GOMEZ-UCHIDA D，SEEB L W，WARHEIT K I，et al.Deep sequencing of the transcriptome and mining of single nucleotide polymorphisms （SNPs） provide genomic resources for applied studies in Chinook salmon （Oncorhynchus tshawytscha）[J].Conservation genetics resources，2014，6（4）：807-811.

[20] JOHANSSON L H，TIMMERHAUS G，AFANASYEV S，et al.Smoltification and seawater transfer of Atlantic salmon （Salmo salar L.） is associated with systemic repression of the immune transcriptome[J].Fish & shellfish immunology，2016，58：33-41.

[21] VALENZUELA-MIRANDA D，BOLTA A S，CABREJOS M E，et al.High-throughput transcriptome analysis of ISAV-infected Atlantic salmon Salmo salarunravels divergent immune responses associated to head-kidney，liver and gills tissues[J].Fish & shellfish immunology，2015，45（2）：367-377.

[22] DAHLE M K，WESSEL ，TIMMERHAUS G，et al.Transcriptome analyses of Atlantic salmon （Salmo salarL.） erythrocytes infected with piscine orthoreovirus （PRV）[J].Fish & shellfish immunology，2015，45（2）：780-790.

[23] KRL E，DOUGLAS A，TOCHER D R，et al.Differential responses of the gut transcriptome to plant protein diets in farmed Atlantic salmon[J].BMC Genomics，2016，17（1）：1-16.

[24] DE SANTIS C，CRAMPTON V O，BICSKEI B，et al.Replacement of dietary soy-with air classified faba bean protein concentrate alters the hepatic transcriptome in Atlantic salmo（Salmo salar）parr[J].Comparative biochemistry and physiology part D：Genomics & proteomics，2015，16：48-58.

[25] PALSTRA A P，FUKAYA K，CHIBA H，et al.The olfactory transcriptome and progression of sexual maturation in homing chum salmon Oncorhynchus keta[J].PLoS One，2015，10（9）：1-17.

[26] KIM J H，LEONG J S，KOOP B F，et al.Multi-tissue transcriptome profiles for coho salmon （Oncorhynchus kisutch），a species undergoing rediploidization following whole-genome duplication[J]Marine genomics，2016，25：33-37.

[27] JIN S B，ZHANG Y，DONG X L，et al.Comparative transcriptome analysis of testes and ovaries for the discovery of novel genes from Amur sturgeon （Acipenser schrenckii）[J].Genetics and molecular research，2015，14（4）：18913-18927.

[28] YUE H M，LI C J，DU H，et al.Sequencing and de novo assembly of the gonadal transcriptome of the endangered chinese sturgeon （Acipenser sinensis）[J].PLoS One，2015，10（6）：1-22.

[29] CHEN Y D，XIA Y T，SHAO C W，et al.Discovery and identification of candidate sex-related genes based on transcriptome sequencing of Russian sturgeon （Acipenser gueldenstaedtii）gonads[J].Physiological genomics，2016，48（7）：464-476.

[30] VIDOTTO M，GRAPPUTO A，BOSCARI E，et al.Transcriptome sequencing and de novo annotation of the critically endangered Adriatic sturgeon[J].BMC Genomics，2013，14：1-16.

[31] YUAN L H，ZHANG X J，LI L M，et al.High-throughput sequencing of microRNA transcriptome and expression assay in the sturgeon，Acipenser schrenckii[J].PLoS One，2014，9（12）：1-18.

[32] ZHU R，DU H J，LI S Y，et al.De novoannotation of the immune-enriched transcriptome provides insights into immune system genes of Chinese sturgeon （Acipenser sinensis）[J].Fish & shellfish immunology，2016，55：699-716.