復合微生物固態發酵菜籽餅粕對抗營養因子去除條件的研究

管維 蘭時樂 詹逸舒 李倩 譚日曉 王璇

摘要?以菜籽餅粕為原料，采用固態發酵法研究了單菌和混合菌發酵對菜籽餅中抗營養因子降解率的影響。通過單因素試驗篩選了菜籽餅發酵去除抗營養因子的菌種及復合微生物固態發酵菜籽餅去除抗營養因子的條件。結果表明，納豆桿菌、側胞桿菌、凝結芽孢桿菌、枯草桿菌去除抗營養因子的效果比較明顯。最佳條件如下：發酵時間為5 d，發酵溫度為35℃，接種量為6%，發酵pH為6.5。在此條件下，植酸、纖維素、單寧的降解率最高分別達到93.74%、36.59%和14.75%。

關鍵詞?菜籽餅;植酸;纖維素;單寧;發酵

中圖分類號?S816.6文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2020）02-0189-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.02.055

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on the Removal Conditions of Anti-nutrients by Rapeseed Meal with Complex Microbe by Solid Fermentation

GUAN Wei1，LAN Shi-le2，ZHAN Yi-shu3 et al?（1.Nanyue District Market Supervision Administration of Hengyang City， Hengyang，Hunan 421900;2.College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 420128;3.Changning Animal Husbandry and Aquatic Affairs Center， Changning， Hunan 421500）

Abstract?The effects of single microbe and mixed microbe fermentation on the degradation rate of anti-nutrients in rapeseed meal were studied by using solid fermentation method， with rapeseed meal as raw materials.Single factor experiment was used to screen out the detoxified strains for removing anti-nutritional factors and the removal conditions of anti-nutritional factors in rapeseed meal.The results showed that the optimal strains were Bacillus natto， Bacillus coagulans，Bacillus laterosporus， Bacillus coagulans andBacillus subtilis.The optimal fermentation conditions were as follows： fermentation time 5 days， fermentation temperature of 35 ℃， inoculum size of 6%，fermentation pH value of 6.5. Under these conditions， the highest degradation rate of phytic acid， cellulose and tannin was 93.74%， 36.59% and 14.75% respectively.

Key words?Rapeseed meal;Phytic acid;Cellulose;Tannin;Fermentation

油菜是我國重要的油料作物，種植面積和總產量均位居世界第一。菜籽餅的營養價值與豆餅接近，氨基酸組成接近聯合國糧農組織（FAO）和世界衛生組織（WHO）推薦值，是一種優良的天然植物蛋白資源。但由于菜籽餅含有硫苷、植酸、纖維素、單寧、芥子堿等抗營養物質，因此菜籽餅用作飼料的應用受到很大限制[1-3]。筆者通過以降解限制菜粕飼用的抗營養物質——植酸、單寧、纖維素為目標，從研究室保藏的菌株中篩選出在菜籽餅粕上生長能力強、高效降解植酸、單寧、纖維素的菌株;用篩選出的菌株混合發酵菜籽餅粕，測定經發酵處理后的菜籽餅粕中各項抗營養因子的降解率[4-8]，旨在為混合菌發酵菜籽餅粕制備益生蛋白飼料提供理論依據和數據參考[9]。在菜粕發酵單因素優化條件研究的基礎上， 探討復合微生物固態發酵菜籽餅粕對抗營養因子的去除條件，探討菜籽餅脫毒的理想發酵時間、發酵溫度、發酵接種量、發酵pH，并對其工藝進行優化，以期獲得最優的菜粕固態發酵工藝參數，從而為菜粕的深度開發利用提供技術支持。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?菌種和菜籽餅粕。

酵母菌、嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、側胞芽孢桿菌，購買于湖南農業大學生物科學技術學院微生物實驗室;菜籽餅粕購買于衡陽市南岳區迎賓市場菜籽榨油坊。

1.1.2?主要儀器與設備。分光光度計，型號V-5000型，為上海元析儀器有限公司產品;恒溫攪拌循環水箱，型號H.H-60，為常州市華普達教學儀器有限公司產品;電子天平，型號KF3102，為凱豐集團有限公司產品;恒溫鼓風干燥箱，型號DHG-9070型，為上海精宏實驗設備有限公司產品;恒溫搖床，型號QYC 2112，為上海福瑪實驗設備有限公司產品。

1.1.3?主要試劑及培養基。

1.1.3.1?發酵培養基。菜籽餅粕88.7%;麥麩10%;葡萄糖 1%;磷酸二氫鉀0.2%;七水硫酸鎂 0.1%，固體與水的比例是1∶1。在125 ℃滅菌25 min即可。

1.1.3.2?PDA培養基（不加瓊脂）。馬鈴薯20 g， 葡萄糖 2 g，水100 mL，pH自然。125 ℃下濕熱滅菌25 min。

1.1.3.3?MRS培養基：葡萄糖2.000%，牛肉膏1.000%，蛋白胨1.000%，酵母提取物0.500%，磷酸二氫鉀0.200%，三水醋酸鈉0.200%，檸檬酸氫二銨0.200%，吐溫-80 0.100%，七水硫酸鎂0.058%，pH 6.2～6.4。125 ℃下濕熱滅菌25 min。

1.1.3.4?牛肉膏蛋白胨培養基（不加瓊脂）。牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，氯化鈉 5 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2。125 ℃下濕熱滅菌25 min。

1.2?試驗方法

1.2.1?植酸含量的測定。采用碘量法[10]測定植酸含量。

1.2.2?纖維素含量的測定。采用硫代硫酸鈉滴定（碘量法）[11]測定纖維素含量。

1.2.3?單寧含量的測定。采用六氰合鐵（Ⅲ）酸亞鐵鉀吸光光度法[12-13]測定單寧含量。

1.2.4?種子培養和發酵培養。

1.2.4.1?種子培養。將保存于斜面上的菌種接種到種子液培養基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養2 d，備用。

1.2.4.2?發酵培養。將接種好的種子液按6%（V/W）的接種量接入發酵培養基中，37 ℃培養5 d，50 ℃下烘干粉碎，測定抗營養因子的含量，并按以下公式計算出其降解率：降解率=發酵前的含量-發酵后的含量/發酵前的含量×100%。

1.2.5?菜籽餅去除抗營養因子菌種的篩選。將枯草桿菌、凝結桿菌、側胞桿菌、酵母菌、乳酸菌、納豆桿菌的種子液按6%接種發酵培養基中，35 ℃下培養5 d，50 ℃下烘干粉碎，測定抗營養因子的含量。

1.2.6?復合菌發酵條件的研究。

通過菜籽餅脫毒，篩選出4種菌（枯草桿菌、凝結桿菌、側胞桿菌、納豆桿菌）作為復合菌，發酵菜籽餅。改變菜籽餅固體發酵條件，如發酵溫度、起始pH、接種量及發酵時間，考察其對抗營養因子去除的影響。

2?結果與分析

2.1?單菌固體發酵菜籽餅對植酸降解率的影響

在250 mL三角瓶中裝入45 g菜籽餅發酵培養基，調節含水量為50%，pH 為7.0，37 ℃下靜置培養6 d，每隔1 d搖動1次，50 ℃下烘干，測定植酸含量，并計算其降解率，結果如圖1所示。由圖1可知，用不同的微生物發酵后，菜籽餅中植酸的含量都有所降低，但降低程度各不相同。經過側胞芽孢桿菌發酵的菜籽餅，其中植酸的降解率最高（89.22%），說明側胞芽孢桿菌的脫毒效果最為明顯。其次，枯草桿菌、納豆桿菌、凝結桿菌的脫毒效果較為理想，降解率分別為74.93%、69.74%和79.48%。這可能說明這4種菌能產生大量植酸酶，分解了菜籽餅中的植酸。脫毒效果較差的是酵母菌和嗜酸乳桿菌，降解率分別為26.75%和11.56%。

2.2?單菌固體發酵菜籽餅對纖維素降解率的影響

在250 mL的三角瓶中裝入45 g菜籽餅發酵培養基，調節含水量為50%，pH為7.0， 37 ℃下靜置培養6 d，每隔1 d搖動1次，50 ℃下烘干，測定纖維素含量，并計算其降解率，結果圖2所示。

由圖2可知，通過不同的微生物發酵后，其纖維素含量均有所降低。微生物在發酵的過程中產生了纖維素酶，纖維素酶分解了纖維素，將纖維素轉化為還原性糖可溶性物質，從而降低了其含量。其中，枯草芽孢桿菌對纖維素的降解率最高（30.75%），去除抗營養因子的效果最為明顯。這可能是因為在發酵過程中微生物產生纖維素酶分解了纖維素。納豆桿菌、凝結桿菌和側胞桿菌的降解率分別為23.15%、15.32%和15.32%。乳酸菌、酵母菌對纖維素的降解率較低（7.66%）。

2.3?單菌固體發酵菜籽餅對單寧降解率的影響

2.3.1?單寧標準曲線的繪制。分別測得不同單寧濃度下的吸光度，以試劑空白為對照，以容量瓶中單寧的濃度（μg/mL）為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，如圖3所示。

2.3.2?單菌發酵對單寧降解率的影響。

在250 mL的三角瓶中裝入45 g菜籽餅發酵培養基，調節含水量為50%，pH為7.0，37 ℃下靜置培養6 d，每隔1 d搖動1次，50 ℃下烘干，測定單寧含量，并計算其降解率，結果如圖4所示。

由圖4可知，通過微生物發酵后，各自菜籽餅中單寧的含量稍有降低，說明微生物在發酵的過程中產生的單寧酶降解了一部分單寧。其中枯草芽孢桿菌對單寧的降解率最高（10.62%），對菜籽餅的脫毒有一定的效果。側胞桿菌、納豆桿菌、凝結桿菌對單寧的降解率分別為7.77%、5.44%和3.89%。酵母菌、乳桿菌對單寧的降解率最低分別為2.85%和1.55%，說明乳桿菌幾乎不降解單寧。

2.4?復合微生物發酵條件研究

2.4.1?發酵時間的確定。將發酵培養基置于37 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養。從發酵第2天開始取樣，以后每隔1 d取樣1次，直至第6天終止培養，在50 ℃下烘干粉碎，測定其抗營養因子的含量，并計算各抗營養因子（單寧、植酸、纖維素）的降解率。由圖5可知，發酵時間達到4 d時，植酸的降解率達到最高，發酵天數為5 d時單寧、纖維素的降解率達到最高。發酵時間為6、7 d時，各抗因子的降解率基本保持不變。因此，發酵5 d是去除抗營養因子的最佳條件。

2.4.2?發酵溫度的確定。

設計發酵溫度為25、30、35、40 ℃，在不同的溫度下發酵5 d，將采集樣品在50 ℃下烘干粉碎，測定其抗營養因子的含量，并計算各抗營養因子（單寧、植酸、纖維素）的降解率。

由圖6可知，當發酵溫度為25 ℃時，抗營養因子的降解率很低，說明溫度低不適合微生物的生長或影響酶的活性。當發酵溫度為30～35 ℃時，各抗營養因子的降解率達到最高。當發酵溫度為40 ℃時，各抗營養因子的降解率有所降低，溫度高對微生物的生長、酶的活性都有影響。因此，發酵溫度為35 ℃是去除抗營養因子的最佳條件。

2.4.3?接種量的確定。發酵的接種量設置為2%、4%、6%、8%和10%，復合菌組比例為1∶1∶1∶1，35 ℃下發酵5 d，發酵后采樣在50 ℃下烘干粉碎，測定其抗營養因子的含量，并計算各抗營養因子（單寧、植酸、纖維素）的降解率。由圖7可知，當接種量為2%時，各抗營養因子的降解率幾乎為零，說明接種量太少時微生物的數量也少。當接種量為6%時，各因子的降解率達到最高。當接種量分別為8%和10%時，各因子的降解率有所降低，說明接種量大，微生物數量多，供微生物生長、活動的營養物質不夠，導致微生物死亡。因此，發酵接種量為6%是去除抗營養因子的最佳條件。

2.4.4?發酵pH的確定。發酵的pH設置為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，接種量為6%，復合菌組內比例為1∶1∶1∶1，在35 ℃下發酵5 d，發酵后采樣在50 ℃下烘干粉碎，測定其抗營養因子的含量，并計算單寧、植酸、纖維素的降解率。

由圖8可知，當pH為5.5時，各抗營養因子的降解率很

低，說明偏酸性不適合微生物的生長，降低了各種酶的活性。

當pH為6.5時，降解率達到最高。當pH在7.0以上時，各因子的降解率逐漸降低。這說明堿性環境不適合微生物的生長與活動。因此，發酵的pH為6.5是去除抗營養因子的最佳條件。

3?結論

該研究對復合微生物固態發酵菜籽餅粕對抗營養因子的去除條件進行研究。從實驗室提供的6種菌（酵母菌 、嗜酸乳桿菌 、枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、側胞芽孢桿菌）中篩選出對抗營養因子（單寧、植酸、纖維素）降解率較高的4種優良菌株（枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、側胞芽孢桿菌），用4種優良菌株復合微生物來發酵菜籽餅粕。研究去除抗營養因子的4個條件因素（發酵時間、發酵溫度、發酵接種量、發酵pH）。確定其他變量，設計單一變量，篩選出每個變量的最優條件。該試驗結果表明，最佳發酵條件為發酵時間為5 d，發酵溫度為35 ℃，接種量為6%，發酵pH為6.5。

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