丙三醇對螺旋霉素I 發酵的影響及機理分析

梁培培， 高淑紅， 姚開亞， 孫玲玲， 張志勇， 賴 珅

（1. 華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237；2. 天方藥業有限公司，河南 駐馬店 463000）

螺旋霉素(Spiramycin)是一種16 元大環內酯類抗生素，是法國實驗室Rhone-Poulenc 于1954 年從生二素鏈霉菌(Streptomyces ambofaciens)的代謝產物中分離所得[1]。螺旋霉素的化學結構主要由一個16 元內酯環及所連接的兩個氨基糖福洛氨糖(Forosamine)、碳霉氨糖(Mycaminose)和一個中性糖碳霉糖(Mycarose)組成[2]。螺旋霉素通過將內酯環結合到細菌核糖體的大亞基上，在空間上阻斷細菌新生肽鏈的延伸，從而達到抑菌效果。因其較強的抗菌活性及持續的抗生素后效性，已被廣泛應用于臨床感染性疾病的治療[3-5]。依據C-3 位原子的酰化程度不同，又可將螺旋霉素分為未被酰化的螺旋霉素Ⅰ，乙酰化的螺旋霉素Ⅱ和丙酰化的螺旋霉素Ⅲ[6]。其中螺旋霉素I 生物效價較高，約是螺旋霉素II、III 的1.8 倍和1.4 倍[7]。

生二素鏈霉菌發酵產生螺旋霉素的發酵液中，產物以螺旋霉素I 為主，并有少量螺旋霉素II、III。除此之外，螺旋霉素發酵液中容易積累多種雜質組分，如雜質F（4'''-N-demethyl spiramycin I dipolymer），雜質A（Neospiramycin），雜質B（Spiramycin Ⅳ），雜質D（Spiramycin V）等，這些組分生物效價不高，且有一定的毒副作用，不僅影響提取收率，還降低了螺旋霉素的產量和品質[8-9]。因此降低雜質組分含量，也成為螺旋霉素生產中的重要指標。

螺旋霉素的合成以短鏈脂肪酸酰基輔酶A 為前體，在Ⅰ型聚酮合酶的催化作用下形成內酯環，內酯環經一系列后修飾步驟，最終形成具有抗菌活性的螺旋霉素分子，其中內酯環的形成被認為是主要的限制性因素[10-11]。發酵液中含量最高的雜質組分是D，其結構是螺旋霉素C-9 位上的福洛氨糖被碳霉糖取代[12]。對螺旋霉素生物合成基因簇的研究表明，與糖基合成相關的基因srm20 和srm33 是分別參與福洛氨糖和碳霉糖合成途徑中的重要基因，分別編碼氨基轉移酶和甲基轉移酶[13-14]。

為改善螺旋霉素的發酵水平，研究人員在前體添加和發酵工藝優化方面均進行了大量研究。其中朱鳳、武培等[15-16]在發酵前期分別添加吐溫-85 和金屬離子Zn2+，促進了菌體代謝，增加了細胞膜的通透性，為螺旋霉素的合成提供了更多的前體物質，促使發酵效價分別提高了11.9%和17%左右，從前體物質增加的角度詮釋了發酵效價提高的原因。Li 等[17]在發酵初期添加Al3+，增加前體物質的同時還提高了與內酯環合成有關的乙酰CoA 合成酶、乙酸激酶及乙酰磷酸轉移酶等的活性，使螺旋霉素效價提高了19.51%。羅俊等[18]在發酵過程中添加氯化膽堿，增加乙酸等前體物質的濃度，增大了三羧酸循環(TCA)循環的通量，使發酵效價提高了15%左右，氯化膽堿作為甲基化試劑在提高效價的同時也顯著降低了雜質F 的含量。胡蓉等[19]在發酵過程中添加丙三醇，增強了糖酵解途徑EMP 途徑和TCA 循環的代謝流，促進細胞的初級代謝，提高了螺旋霉素的生產速率和產量。上述文獻從多個方面對螺旋霉素發酵工藝進行了優化，但并未從分子層面深入了解螺旋霉素產量提高及雜質含量降低的原因。Fondi 等[20]通過代謝建模研究發現，過表達srm4 基因能夠增強CoA 代謝途徑的碳流量，進而顯著提高螺旋霉素的生產力。Yao 等[12]嘗試從基因轉錄層面研究了不同糊精對生二素鏈霉菌發酵的影響，解釋了螺旋霉素產量提高及雜質組分降低的原因。

本文研究不同發酵階段添加丙三醇對螺旋霉素Ⅰ發酵的影響，優化其最佳添加時間和添加濃度，并進一步通過熒光定量PCR(Polymerase Chain Reaction)技術，從基因轉錄水平，研究與螺旋霉素I 發酵產量提高、雜質D 組分含量降低相關的原因。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

生二素鏈霉菌(Streptomyces ambofaciens)，為本實驗室貯存菌株；糊精、玉米漿、黃豆餅粉等來源于天方藥業有限公司；氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸鋅等常規試劑均為國產分析純，乙腈、甲醇為色譜級。RNA 抽提試劑盒購自TIANGEN 生物科技有限公司，PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 試劑盒購自日本TaKaRa 公司，SYBR Premix Ex TaqTMGC 試劑盒購自日本TaKaRa 公司。

1.2 儀器和設備

高效液相色譜儀Agil ent Technologies 1260 Infinity(安捷倫科技有限公司)；15 L 發酵罐BSW-A(上海國強生物工程設備有限公司)；搖床SPH-3222(上海世平實驗設備有限公司)；小型高速冷凍離心機Centrifuge5415-R(德國Eppendorf 公司)；實時熒光定量PCR 儀CFX96(美國Bio-Rad 公司)。

1.3 培養基組分

一級種子培養基(g/L)：糊精45，黃豆餅粉15，玉米漿10，碳酸鈣5，pH 7.0。

二級種子培養基(g/L)：糊精40，黃豆餅粉8，酵母粉5，硫酸銨2，氯化鈉3，磷酸二氫鉀1，玉米漿12，碳酸鈣5，豆油20，pH 7.0。

搖瓶發酵培養基(g/L)：糊精65，黃豆餅粉5，酵母粉5，硫酸銨4，氯化鈉15，磷酸二氫鉀4，硫酸鎂1，硫酸鋅0.1，玉米漿3，氯化鈷0.003，碳酸鈣10，豆油20，pH 7.0。

15 L 發酵罐培養基(g/L)：糊精50，葡萄糖12，酵母粉2.5，硫酸銨2，磷酸二氫鉀4，氯化鈉3，硫酸鋅1，硫酸鎂1，氯化鈷0.3，玉米漿20，碳酸鈣14，豆油20，泡敵0.2，pH 7.0。

1.4 實驗方法

搖瓶培養：將1 mL 冷凍保藏的種子液接種于裝有30 mL 一級種子培養基的250 mL 三角瓶中，在轉速220 r/min，溫度(28.0±0.5) ℃下培養48 h。然后將一級種子液按6%接種量接入裝有25 mL 發酵培養基的250 mL 三角瓶中搖瓶中，在轉速220 r/min，溫度(27.0±0.5) ℃下培養6 d。

15 L 發酵罐培養：將一級種子液按6%的接種量轉接到裝有60 mL 二級種子培養基的500 mL 三角瓶中，在轉速220 r/min，溫度(28.0±0.5) ℃下培養26 h。然后將二級種子液按照6%接種量接入15 L 發酵罐中，培養基裝液量10 L，培養溫度26.5 ℃，發酵6～7 d，并根據發酵過程中的參數變化調整轉速和補料。

運用高效液相色譜(HPLC)法測定螺旋霉素效價與雜質含量：取發酵液1 mL，在轉速12 000 r/min下離心10 min，取上清液用流動相進行稀釋，經0.22 μm的濾膜過濾后進樣。

色譜柱及測試條件：ZORBAX SB-C8 色譜柱(安捷倫科技有限公司，250 mm×4.6 mm×5 μm)，流動相為9.3 g/L 高氯酸鈉磷酸鹽緩沖液和乙腈，高氯酸鈉磷酸鹽緩沖液和乙腈的體積比為7∶3；流速1 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長232 nm，進樣量20 μL。外標法測定螺旋霉素Ⅰ效價。雜質D 質量分數為雜質峰面積除以螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ峰面積與雜質A、B、F、D 峰面積之和。

總RNA 提取、反轉錄及熒光定量PCR 反應：采取液氮研磨的方法獲得總RNA，然后42 ℃水浴2 min將樣品中的基因組DNA 去除，最后在37 ℃反應15 min，85 ℃加熱5 s 終止反應，得到cDNA，并于-20 ℃保存。最后進行熒光定量PCR 反應，95 ℃預變性30 s，95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共40 個循環。本實驗以2-ΔΔCt法來考察基因的轉錄水平差異。

2 結果與分析

2.1 丙三醇添加時間與添加濃度的優化

螺旋霉素Ⅰ主要化學結構及化學組成分別如圖1和表1 所示。本實驗選擇在搖瓶發酵0、24、48、72、96、120 h 這6 個時間點進行添加，添加體積分數均為0.55%。圖2 示出了丙三醇添加時間及添加體積分數對螺旋霉素Ⅰ合成的影響（以CK 為對照組）。由圖2 可知，添加時間為24 h 時，螺旋霉素I 效價比對照組顯著提高10.87%（p＜0.05），添加時間為0 時，螺旋霉素I 效價顯著降低24.51%（p＜0.01），其余時間點添加效果不顯著。由上述發酵結果可知，丙三醇的最佳添加時間是24 h。

實驗進一步選擇丙三醇體積分數分別為0.2%、0.4%、0.55%、0.7%、0.9%和1.2%，添加時間均為搖瓶發酵24 h，研究其添加體積分數對螺旋霉素I 發酵的影響。由圖2 可知，丙三醇最終體積分數為0.4%時，螺旋霉素I 效價顯著提高17.12%（p＜0.01），其他濃度添加效果不顯著。

搖瓶發酵24 h 時添加最終體積分數為0.4%的丙三醇，提高了螺旋霉素I 效價，而螺旋霉素Ⅱ和螺旋霉素Ⅲ含量變化不顯著(圖略)，同時雜質組分含量也有一定程度的降低（圖3），其中雜質D 質量分數顯著降低21.39%（p＜0.01），其余3 種雜質的質量分數變化不大，因此后續主要研究雜質D 的質量分數的變化。

2.2 15 L 發酵罐放大實驗

實驗進一步在15 L 發酵罐中研究添加丙三醇對發酵過程的影響，與搖瓶相比，發酵罐的供氧條件較好，營養物質供應更為充足，菌體在發酵罐中生長更快，產素期提前。實驗選擇12、15、18、24 h 這4 個時間點一次性補入最終體積分數為0.4%的丙三醇溶液，實驗結果如圖4 所示。

圖 1 螺旋霉素的主要化學結構Fig. 1 Main chemical structure of spiramycin

表 1 螺旋霉素的主要化學組成Table 1 Main chemical formula of spiramycin

圖 2 丙三醇添加時間及添加體積分數對螺旋霉素I 合成的影響Fig. 2 Influences of the adding time and adding volume fraction of glycerol on the synthesis of spiramycinⅠ

由圖4 可知，在上述4 個時間點添加丙三醇對螺旋霉素I 的合成均有一定的促進作用，其中15 h 添加促進效果最顯著（p＜0.01）。根據發酵結果，實驗選擇在分酵15 h 向15 L 發酵罐中添加最終體積分數為0.4%的丙三醇溶液作為最優添加條件。

圖 3 優化丙三醇添加時間和添加體積分數下雜質含量的變化Fig. 3 Change of impurity content at the optimal adding time and adding volume fraction of glycerol

圖 4 丙三醇添加時間對螺旋霉素Ⅰ合成的影響Fig. 4 Influence of glycerol adding time on the synthesis of spiramycin Ⅰ

未添加丙三醇的對照罐與15 h 添加最終體積分數為0.4%的丙三醇溶液的條件罐的發酵過程中效價和雜質D 的變化如圖5 所示，可以看出，添加丙三醇罐螺旋霉素 I 起始效價高于未添加罐，并在整個發酵過程中保持較高的增長趨勢，發酵結束時，添加丙三醇罐的螺旋霉素 I 最終效價（23 314 U/mL）相比未添加罐（18 329 U/mL）顯著提高27.20%（p＜0.01）。

添加丙三醇罐的雜質D 的質量分數在整個發酵過程中都不高于未添加罐，尤其120 h 以后，前者雜質D 質量分數的增長趨勢明顯低于后者，發酵結束時，前者雜質D 的質量分數(8.84%)與后者(11.99%)相比顯著降低26.27%（p＜0.01）。同時還測定了螺旋霉素Ⅱ和螺旋霉素Ⅲ的質量分數，結果如圖6 所示，發酵過程中添加丙三醇罐二者質量分數比未添加罐稍低，發酵結束時兩罐二者質量分數基本一致。

圖 5 效價和雜質D 的變化趨勢Fig. 5 Tendency of the titer and impurity D

圖 6 螺旋霉素Ⅱ和螺旋霉素Ⅲ的變化趨勢Fig. 6 Tendency of the spiramycin Ⅱ and spiramycin Ⅲ

2.3 添加丙三醇對螺旋霉素I 合成相關基因轉錄水平的影響

為從基因層面探究螺旋霉素I 內酯環合成、兩種糖苷配基的合成與雜質D 組分合成之間的關系，實驗以鏈霉菌初級sigma 因子編碼基因hrdB 為參比，對螺旋霉素發酵過程中相關基因srm10（內酯環合成相關基因），srm20和srm33 轉錄水平進行了檢測。

在螺旋霉素I 的生物合成過程中，限制性因素內酯環的合成通常在Ⅰ型聚酮合酶的催化作用下完成。圖7 示出了發酵15 h 時添加最終體積分數為0.4%的丙三醇溶液的條件罐相對于未添加丙三醇的對照罐，srm10，srm20 和srm33 基因的相對轉錄結果。由圖可知，發酵48 h 時，添加丙三醇后srm10 基因的轉錄水平是未添加罐基因轉錄水平的近3 倍，說明添加丙三醇能有效促進發酵早期srm10 基因的轉錄，發酵72 h 后兩罐基因轉錄水平相當，說明72 h以后srm10 基因的轉錄水平變化不大。另外，添加丙三醇能顯著提高發酵72 h 時srm20 與srm33 基因的轉錄水平（p＜0.01）；添加丙三醇對其他時間點的srm20 與srm33 基因轉錄無顯著作用。

圖 7 srm10，srm20 和srm33 基因相對轉錄結果Fig. 7 Relative transcription of genes srm10, srm20 and srm33

Karray 等[14]研究發現，螺旋霉素合成相關基因srm10、srm20 與srm33 有相似的轉錄模式，發酵36 h轉錄水平升高，之后轉錄水平下降。發酵生成螺旋霉素的過程是從40～48 h 以后開始持續合成至72 h。我們的實驗結果顯示，srm10 基因在48 h 大量轉錄，而與糖基合成的相關基因srm20 和srm33 在72 h左右達到峰值，說明在螺旋霉素合成過程中大環合成基因以及糖基合成基因存在時序變化，內酯環合成后連接糖基形成完整的螺旋霉素分子。

雜質D 與螺旋霉素I 結構上的差異在于C-9 位的糖苷配基由福洛氨糖錯配成碳霉糖，當碳霉糖的相對合成增加或者福洛氨糖的相對合成減少，都會導致雜質D 的增加[12]。從srm20 和srm33 基因轉錄的時序變化來看，添加丙三醇對72 h 時srm20 的促進作用更大，猜測福洛氨糖合成相關基因的轉錄促進了福洛氨糖的合成，從而使得較多福洛氨糖連接在母環上，減少了螺旋霉素雜質D 的合成。

3 討 論

為研究丙三醇的添加工藝，添加最終體積分數為0.4%的丙三醇搖瓶發酵24 h 能夠有效促進螺旋霉素I 的合成，效價達到20 982 U/mL，與對照值(17 915 U/mL)相比提高了17.12%，雜質D 的質量分數 為 8.16%， 與 對 照 值 (10.38%)相 比 降 低 了21.39%。在15 L 發酵罐中進行放大實驗，15 h 左右向罐中添加最終體積分數為0.4%的丙三醇溶液，發酵結束時，螺旋霉素I 最終效價達到23 314 U/mL，相比對照(18 329 U/mL)提高27.20%，最終雜質D 含量為8.84%，與對照(11.99%)相比降低了26.27%。

選擇與螺旋霉素生物合成相關的基因進行轉錄水平的研究，實驗選取與內酯環合成相關的基因srm10，福洛氨糖合成通路上的基因srm20 以及碳霉糖合成通路上的基因srm33[13-14]。結果顯示，添加丙三醇罐的srm10 基因在48 h 轉錄水平明顯高于未添加罐，同時srm20 與srm33 基因在72 h 轉錄水平明顯高于未添加罐。

螺旋霉素生物合成過程中，限制性因素內酯環的合成需要諸多前體物質在眾多酶的催化下產生。其中短鏈脂肪酸可作為前體物質在CoA 合成酶及與酰基磷酸轉移酶耦聯的酰基激酶兩種酶系催化作用下可轉化成內酯環合成所需的直接前體物質CoA[21]。胡蓉等[18]研究發現，丙三醇有利于乙酸和丙酸等前體物質的積累，從而提高了螺旋霉素效價。Khaoua 等[21]研究發現，短鏈脂肪酸能夠誘導酰基激酶和酰基磷酸轉移酶的合成，進而提高螺旋霉素產量。Ⅰ型聚酮合酶體系是螺旋霉素內酯環生物合成過程中最為重要的組成部分，已活化的酰基單元在其催化下聚合成內酯環[10]。Ⅰ型聚酮合酶基因簇由5 個亞單元組成，srm10 基因作為其中一個亞單元，其轉錄水平的高低與內酯環的合成密切相關[14]。猜測丙三醇的添加，促進了乙酸、丙酸等短鏈脂肪酸的積累，從而誘導了酰基激酶和酰基磷酸轉移酶的合成，提高了短鏈脂肪酸轉化成酰基CoA 的效率，為螺旋霉素合成提供更多的直接前體物質，同時丙三醇的添加提高了發酵前期Ⅰ型聚酮合酶亞單元合成基因srm10 的轉錄水平，對酰基單元縮合成聚酮類內酯環起促進作用，從而增加內酯環的合成。

螺旋霉素內酯環本身沒有抑菌活性，已合成的內酯環還需在酶的催化作用下進行一系列的后修飾步驟才能形成具有抑菌活性的螺旋霉素分子，其中糖基是活化內酯環的關鍵基團，在抑菌方面發揮重要作用[22]。后修飾過程中，糖基的錯配和缺失都會導致相關雜質的產生。其中雜質D 的產生與福洛氨糖和碳霉糖的不均一合成有關，當C-9 位的福洛氨糖被碳霉糖取代后形成雜質D[12]。srm20 和srm33 分別是福洛氨糖和碳霉糖合成途徑上的基因，對兩種糖基的合成起重要作用[13-14]。實驗結果顯示，添加丙三醇能使得發酵72 h 左右的srm20 和srm33 基因的轉錄水平大幅提高，且對srm20 的促進作用更大，進而促進了福洛氨糖對碳霉糖相對合成比例的增加，導致雜質D 組分的含量下降。上述實驗結果為今后雜質D 組分含量的進一步降低提供了新的思路，萬俊仙等[23]已通過過表達半胱氨酸合成途徑中兩個限速酶基因，提高了細胞內半胱氨酸水平。我們可以通過基因工程改造的辦法提高srm20 基因表達，或降低srm33 的基因表達，降低雜質D 含量，提高螺旋霉素I 的品質。