二維斑點(diǎn)追蹤技術(shù)評(píng)價(jià)牛磺酸對(duì)宮內(nèi)發(fā)育遲緩大鼠心功能的影響

趙秋霞，劉 蓉*，劉朝奇，董芝芝，陳 悅

(1.三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 宜昌市中心人民醫(yī)院超聲科，湖北 宜昌 443003；2.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002)

宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growth restriction， IUGR)是指出生時(shí)體質(zhì)量低于同孕齡同性別胎兒平均體質(zhì)量2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差或第10百分位數(shù)，或孕37周胎兒體質(zhì)量小于2 500 g[1]，是圍產(chǎn)兒死亡的重要原因之一，在美國(guó)發(fā)生率約10%，在我國(guó)發(fā)生率約8.8%[2-3]。IUGR與成年后心血管疾病密切相關(guān)[4]，早期干預(yù)治療可降低晚年患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[5]。研究[6]表明牛磺酸可對(duì)抗心肌缺血/再灌注損傷。通過追蹤心肌自然聲學(xué)斑點(diǎn)，利用斑點(diǎn)追蹤技術(shù)(speckle tracking imaging， STI)可客觀、定量評(píng)價(jià)心肌運(yùn)動(dòng)及形變，較準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)局部和整體心功能[7]。本研究應(yīng)用二維STI評(píng)價(jià)牛磺酸對(duì)IUGR大鼠心功能的影響。

1 資料與方法

1.1 IUGR動(dòng)物模型建立 體質(zhì)量250～260 g SD大鼠16只(雄性6只，10只雌性無(wú)交配史)，由三峽大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。對(duì)雌鼠每日下午6時(shí)進(jìn)行陰道涂片。將處于發(fā)情期的雌鼠與雄鼠按2:1隨機(jī)合籠1晚，次日晨8時(shí)行陰道涂片檢測(cè)，以陰道栓或光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)精子作為妊娠第1日，單籠喂養(yǎng)孕鼠。妊娠第1天起，隨機(jī)選擇2只孕鼠給予正常飲食，其幼鼠出生后納入正常對(duì)照組；另8只孕鼠給予限制蛋白飲食[8]，幼鼠出生后稱重，將出生體質(zhì)量低于正常對(duì)照組平均體質(zhì)量2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的幼鼠定義為IUGR。IUGR幼鼠出生后隨機(jī)分為IUGR組、IUGR+低劑量牛磺酸組(低劑量組)及IUGR+高劑量牛磺酸組(高劑量組)，每組各9只。后2組幼鼠出生后開始灌胃給予牛磺酸(低劑量組每日200 mg/kg體質(zhì)量，高劑量組每日400 mg/kg體質(zhì)量)，正常對(duì)照組、IUGR組給予200 mg/kg體質(zhì)量生理鹽水。

1.2 左心室功能檢測(cè) 采用Philips EPIQ 7C超聲診斷儀，S8-3(頻率3～5 MHz)探頭。稱取出生4周大鼠體質(zhì)量，用10%水合氯醛以0.4 ml/100 g劑量行腹腔注射麻醉后，胸部備皮，仰臥保定于平板上，連接肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖。采集左心室乳頭肌水平穩(wěn)定心律下連續(xù)10個(gè)心動(dòng)周期的二維動(dòng)態(tài)圖像，輸入Philips QLab工作站進(jìn)行脫機(jī)后圖像處理分析，在收縮末期或收縮中期手動(dòng)勾勒心內(nèi)膜和心外膜，目測(cè)并反復(fù)調(diào)整直至最佳追蹤，獲得左心室局部周向峰值應(yīng)變，測(cè)值取10個(gè)心動(dòng)周期的平均值。

1.3 HE染色檢測(cè) 結(jié)束上述檢查后處死大鼠，依次完成心臟取材、脫水、包埋、切片。先行Harris蘇木素染色3～8 min，再用1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，然后0.6%氨水返藍(lán)，最后將切片入伊紅染液中染色1～3 min后脫水透明，從二甲苯中取出稍晾干后用中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下，細(xì)胞核為藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)為紅色。

1.4 心肌組織Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達(dá)量檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)方法。以10%中性甲醛溶液固定大鼠心肌組織，制作成蠟塊，切片厚度4 μm，正常血清工作液試劑封閉，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗(Ⅰ型膠原抗體稀釋比例為1∶200；Ⅲ型膠原抗體稀釋比例為1∶300)；二抗為通用型辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體，二氨基聯(lián)苯胺法(DAB法)顯色，蘇木素染色后脫水封片。光學(xué)顯微鏡下，蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色，棕黃色為DAB顯出陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。用±s表示計(jì)量資料，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量情況 出生時(shí)，與正常對(duì)照組相比，3組幼鼠體質(zhì)量均明顯減低(P均<0.05)。出生4周，與正常對(duì)照組相比，IUGR組體質(zhì)量無(wú)明顯改變(P>0.05)。與IUGR組相比，低劑量組、高劑量組幼鼠體質(zhì)量均無(wú)明顯改變(P均>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量及局部周向應(yīng)變情況(±s)

表1 各組大鼠體質(zhì)量及局部周向應(yīng)變情況(±s)

分組出生時(shí)體質(zhì)量(g)4周后體質(zhì)量(g)局部周向峰值應(yīng)變(%)IUGR組(n=9)41.23±1.27?242.31±1.94-5.13±1.29?低劑量組(n=9)40.92±1.51?241.58±1.71-8.77±1.53△高劑量組(n=9)41.31±1.49?241.92±1.68-11.28±2.69△#正常對(duì)照組(n=9)49.12±2.14242.14±2.53-10.16±2.15F值56.6770.59416.387P值<0.0010.623<0.001

注：*:與正常對(duì)照組比較，P<0.05；△：與IUGR組比較，P<0.05；#：與低劑量組比較，P<0.05

圖2 出生4周各組大鼠心肌細(xì)胞(HE，×400) A.正常對(duì)照組； B.IUGR組心肌細(xì)胞較正常對(duì)照組數(shù)量減少，體積增大； C. 相比IUGR組，低劑量組心肌細(xì)胞較數(shù)量無(wú)明顯改變而體積減小； D.高劑量組數(shù)量無(wú)明顯改變，體積減小更著

2.2 二維STI評(píng)價(jià)牛磺酸對(duì)IUGR大鼠心功能的影響 出生時(shí)受幼鼠心臟體積限制，無(wú)法采集乳頭肌水平短軸切面動(dòng)態(tài)圖像。出生4周后，與正常對(duì)照組相比，IUGR組左心室局部周向峰值應(yīng)變顯著降低(P<0.05)。與IUGR組相比，低劑量組和高劑量組左心室局部周向峰值應(yīng)變顯著增高(P均<0.05)。與低劑量組相比，高劑量組左室局部周向峰值應(yīng)變顯著增高(P<0.05)。見表1、圖1。

2.3 牛磺酸對(duì)IUGR大鼠心肌細(xì)胞影響 與正常對(duì)照組相比，IUGR組大鼠心肌細(xì)胞數(shù)量減少、體積增大。與IUGR組相比，低劑量組和高劑量組心肌細(xì)胞數(shù)量無(wú)改變而體積減小。見圖2。

2.4 大鼠心肌Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達(dá)情況 與正常對(duì)照組相比，IUGR組Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)增高。與IUGR組相比，低劑量組、高劑量組Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)減低，高劑量組更著。見圖3、4。

圖1 出生4周各組大鼠左心室縱向峰值應(yīng)變 A.正常對(duì)照組左心室局部周向峰值應(yīng)變-10.0%； B.IUGR組左心室局部周向峰值應(yīng)變-4.1%； C.低劑量組左心室局部周向峰值應(yīng)變-7.7%； D.高劑量組左心室局部周向峰值應(yīng)變-11.8%

圖3 出生4周各組大鼠心肌Ⅰ型膠原表達(dá)(免疫組織化學(xué)，×400) A.正常對(duì)照組心肌； B.IUGR組心肌Ⅰ型膠原表達(dá)較正常對(duì)照組增多； C.相比IUGR組，低劑量組心肌Ⅰ型膠原表達(dá)減少； D.相比IUGR組，高劑量組心肌Ⅰ型膠原表達(dá)減少

圖4 出生4周各組大鼠心肌Ⅲ型膠原表達(dá)(免疫組織化學(xué)，×400) A.正常對(duì)照組； B.IUGR組Ⅲ型膠原較正常對(duì)照組增多； C.I低劑量組Ⅲ型膠原表達(dá)較IUGR組減少； D.高劑量組Ⅲ型膠原表達(dá)較IUGR組減少

3 討論

IUGR新生兒更易發(fā)生窒息、低氧血癥、胎糞吸入綜合征、酸中毒及低血糖等，是圍生期死亡和長(zhǎng)期發(fā)病的主要原因，IUGR患兒圍產(chǎn)兒死亡率是健康圍產(chǎn)兒的4～6倍[1.9]。研究[10]發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)前子宮內(nèi)慢性缺氧、營(yíng)養(yǎng)不良、胎盤血管阻力增加等因素可導(dǎo)致胎兒心臟壓力和容積超負(fù)荷，使胎兒形成適應(yīng)機(jī)制，繼而誘發(fā)心血管重構(gòu)，可能是成人心血管死亡率升高的主要機(jī)制之一。牛磺酸在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有滲透調(diào)節(jié)、抗炎、鈣離子處理、氧化應(yīng)激和線粒體蛋白合成調(diào)控等功能，是心肌細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的游離氨基酸，對(duì)心臟具有正性肌力作用[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，IUGR組大鼠出生時(shí)體質(zhì)量顯著減輕；出生4周后，與正常對(duì)照組相比，IUGR組體質(zhì)量無(wú)明顯改變，與IUGR組相比，低劑量、高劑量組體質(zhì)量無(wú)明顯改變，主要原因可能是限制生長(zhǎng)的因素去除后，IUGR大鼠會(huì)表現(xiàn)出生長(zhǎng)速度增加，即追趕生長(zhǎng)現(xiàn)象。上述結(jié)果提示，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可促進(jìn)IUGR大鼠生長(zhǎng)發(fā)育[12]，而牛磺酸的效果并不明顯。

二維STI無(wú)角度依賴性，不受前后負(fù)荷影響，能早期準(zhǔn)確檢測(cè)局部及整體心肌運(yùn)動(dòng)功能[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，IUGR大鼠左心室局部周向峰值應(yīng)變減低，提示IUGR大鼠局部心功能發(fā)生改變；低劑量牛磺酸能夠增加IUGR大鼠左心室局部周向峰值應(yīng)變，而高劑量牛磺酸組左心室局部周向峰值應(yīng)變更接近正常對(duì)照組，表明牛磺酸能改善局部心肌運(yùn)動(dòng)功能，以高劑量為著。ITO等[13]發(fā)現(xiàn)，敲除大鼠牛磺酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因?qū)е碌呐；撬崛狈蓪?dǎo)致大鼠心功能降低，也提示心功能改變可能與牛磺酸相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)IUGR大鼠發(fā)生心臟重構(gòu)，與SCHIPKE等[9]的結(jié)果一致。心臟重構(gòu)主要為心肌細(xì)胞及細(xì)胞外間質(zhì)發(fā)生改變。心肌細(xì)胞重構(gòu)主要是心肌細(xì)胞數(shù)量和體積的改變，細(xì)胞外間質(zhì)重構(gòu)主要是Ⅰ型和Ⅲ型膠原重構(gòu)。Ⅰ型膠原含量最多，約占心肌膠原總量的80%。Ⅰ型及Ⅲ型膠原均能維持心臟結(jié)構(gòu)和功能的完整性。心肌發(fā)生重構(gòu)后，Ⅰ型膠原增加可使心肌僵硬度增加，而Ⅲ型膠原增加則可提高心肌順應(yīng)性。出生4周后，與正常對(duì)照組相比，IUGR組大鼠心肌細(xì)胞減少、體積增大，Ⅰ型及Ⅲ型膠原表達(dá)增高，表明IUGR大鼠發(fā)生了心臟重構(gòu)，而心肌細(xì)胞數(shù)量減少可能通過心肌細(xì)胞肥大加以代償[10]。補(bǔ)充牛磺酸后，與IUGR組相比，低劑量組與高劑量組心肌細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯變化，體積減小，Ⅰ型及Ⅲ型膠原表達(dá)下降，表明牛磺酸能延緩心肌代償，抑制Ⅰ型及Ⅲ型膠原合成，起到抗心肌纖維化、抑制心肌重構(gòu)作用，高劑量牛磺酸效果更好。牛磺酸影響心功能的潛在生化機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)肌漿網(wǎng)Ca2+的儲(chǔ)存能力，影響鈣激活A(yù)TP泵的泵送速率或離子通道[14]；此外，有報(bào)道[15]稱牛磺酸具有強(qiáng)大的抗氧化作用，可能在心功能改變中發(fā)揮積極作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)牛磺酸能提高大鼠左心室局部周向峰值應(yīng)變，抗心肌纖維化，400 mg/kg體質(zhì)量牛磺酸干預(yù)治療效果更佳。本研究主要不足在于受探頭及大鼠心臟體積的限制，僅分析了出生4周的大鼠左心室局部周向峰值應(yīng)變，未檢測(cè)分析徑向及縱向應(yīng)變，且牛磺酸對(duì)IUGR大鼠心功能影響的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步觀察。